6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1. Phương pháp parafin phát hiện bệnh Marek

6.1.1. Lấy mẫu

Chọn từ 3 con gà đến 5 con gà có triệu chứng điển hình mổ lấy các mẫu bệnh phẩm sau:

- Dây thần kinh: lấy hai dây thần kinh đùi và hai dây thần kinh cánh, độ dài khoảng 2 cm;

- Gan: lấy phần gan nghi có bệnh tích với độ dày khoảng 0,5 cm;

- Lách: cắt một miếng với độ dày khoảng 0,5 cm;

- Túi Fabricius: cắt ngang túi Fabricius;

- Tuyến ức: lấy toàn bộ tuyến;

...

...

...

- Mắt: cắt đứt phần da xung quanh hố mắt và các dây thần kinh;

- Bệnh phẩm da: lấy phần da có các nang lông sưng to.

Các mẫu bệnh phẩm trên cho vào lọ chứa formalin (3.1.1) sao cho thể tích mẫu bệnh phẩm và formalin có tỷ lệ khoảng 1 : 10, ghi ký hiệu mẫu trên lọ.

6.1.2. Bảo quản mẫu

Mẫu bệnh phẩm (6.1.1) được đảm bảo ngập trong formalin (3.1.1), tránh đổ vỡ, rơi vãi formalin ra ngoài môi trường; khi gửi mẫu đến phòng thí nghiệm, bao gói lọ chứa mẫu bằng túi nilon, miệng túi được dán kín. Trong phòng thí nghiệm, nếu chưa xét nghiệm ngay, mẫu phải được bổ sung hoặc thay mới formalin, đảm bảo thể tích mẫu bệnh phẩm và formalin đạt tỷ lệ khoảng 1 : 10.

CHÚ THÍCH: Đồng thời kèm theo Phiếu gửi bệnh phẩm ghi rõ yêu cầu xét nghiệm và những thông tin về dịch tễ, các biểu hiện triệu chứng, bệnh tích của bệnh.

6.1.3. Chuẩn bị mẫu

- Mẫu bệnh phẩm (6.1.1) được cố định trong dung dịch formalin (3.1.1) trong 24 h;

- Cắt các bệnh phẩm đã cố định trên thành miếng nhỏ dày khoảng 1 mm, dài khoảng 1 cm rồi đặt vào khuôn nhựa (4.1.1).

...

...

...

6.1.4.1. Đúc khuôn

- Rửa khuôn nhựa (6.1.3) dưới vòi nước chảy, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2) thời gian từ 2 đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.1.3) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.1.3) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.1.6) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

...

...

...

CHÚ THÍCH: Nếu sử dụng máy xử lý mẫu mô tự động (4.1.2) thì tiến hành tiếp theo từ bước ngâm etanol.

- Đúc khuôn: rót parafin (3.1.6) được nóng chảy từ nồi đun parafin (4.1.3) vào khay sắt (4.1.4), gắp bệnh phẩm từ khuôn nhựa vào khay sắt, đặt khuôn nhựa (4.1.1) lên trên. Để nguội, tách lấy khối parafin.

6.1.4.2. Cắt tiêu bản

- Cắt gọt khối parafin (6.1.4.2) cho bằng phẳng, đặt trên mặt máy làm lạnh tiêu bản (4.1.5);

- Đặt khối parafin lên máy cắt tiêu bản (4.1.6) sao cho mặt khối parafin song song với mép lưỡi dao, cắt bỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đủ các bệnh phẩm, điều chỉnh độ dày của lát cắt từ 3 mm đến 5 mm, cắt một vài lát;

- Chọn lát cắt phẳng thả vào nồi dãn tiêu bản (4.1.7) với nhiệt độ nước từ 35 °C đến 40 °C; dùng phiến kính (4.1.8) vớt lát cắt. Dựng nghiêng tiêu bản và để khô.

6.1.4.3. Nhuộm tiêu bản

- Ngâm tiêu bản (6.1.4.2) vào cốc xylen (3.1.3) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;

...

...

...

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm haematoxylin (3.1.4), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm eosin (3.1.5), thời gian từ 60 s đến 90 s;

- Rửa dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Loại bỏ nước còn bám trên tiêu bản bằng cách ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2) trong thời gian từ 3 s đến 5 s, sau đó ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 s đến 5 s; chuyển tiêu bản ngâm trong cốc xylen (3.1.3) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 2 min đến 3 min; gắn lamen (4.1.9) vào tiêu bản bằng keo dán lamen (3.1.7). Để khô, soi tiêu bản dưới kính hiển vi quang học (4.1.11).

6.1.5. Đọc kết quả^[1]

- Ở cả hai thể cấp tính và thể mạn tính, bệnh khởi đầu bằng việc tăng sinh các tế bào lympho đa hình thái. Đặc điểm tế bào ở u lympho trong bệnh Marek là các tế bào lympho không đồng nhất về kích thước và độ bắt màu. Các nguyên bào lympho, tế bào lympho to, nhỏ, trung bình và các đại thực bào xâm nhập, trong đó ưu thế là tế bào lympho nhỏ và vừa không đều nhau, nguyên sinh chất bắt màu hồng;

...

...

...

- Tại gan phát hiện các đám tế bào lympho nằm ở ngoại vi mạch quản;

- Tại lách phát hiện các đám tế bào lympho phân bố tràn lan;

- Tại tuyến ức và túi Fabricius số lượng các tế bào lympho giảm;

- Mạch ở tiểu não, đại não và thùy mắt bị viêm, có các tế bào viêm xâm nhập, chủ yếu loại tế bào lympho.

6.1.6. Chẩn đoán phân biệt về bệnh tích vi thể giữa bệnh Marek và bệnh Lympho leuko

Chẩn đoán phân biệt về bệnh tích vi thể giữa bệnh Marek và bệnh Lympho leuko theo Bảng 2.

Bảng 2 - So sánh bệnh tích vi thể

Đặc điểm

Bệnh Marek

...

...

...

Bệnh tích ở dây thần kinh ngoại biên

Thường xuyên có tế bào viêm

Không có

U cục ở gan

Các đám tế bào tăng sinh thường ở ngoại vi mạch quản

Các đám tế bào tăng sinh thường dạng điểm hoặc tràn lan

U cục ở lách

Các đám tế bào tăng sinh trong khối u thường tràn lan

Các đám tế bào tăng sinh trong khối u thường dạng điểm

...

...

...

Các đám tế bào tăng sinh trong các u nằm ở giữa các nang và/hoặc nang bị teo giảm

Các đám tế bào tăng sinh trong các u cục nằm rải rác trong các nang

Tế bào lympho tăng sinh ở da, nang lông

Thường xuyên

Không có

Bệnh tích ở hệ thần kinh trung ương

Có thể có

Không có

Tế bào ở các u cục

...

...

...

Các nguyên bào lympho đồng đều về kích thước, màu sắc

6.2. Phương pháp realtime PCR phát hiện virus gây bệnh Marek

6.2.1. Lấy mẫu

Chọn từ 3 con gà đến 5 con gà có triệu chứng điển hình mổ lấy dây thần kinh, gan, lách, nang lông (khối lượng tổng các loại từ 3 g đến 5 g) cho vào túi hoặc lọ đựng mẫu vô trùng, ghi ký hiệu mẫu trên thành lọ.

6.2.2. Bảo quản mẫu

Mẫu bệnh phẩm (6.2.1) đựng trong túi kín và được bảo quản trong thùng lạnh (có nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C và gửi đến phòng thí nghiệm không quá 48 h. Trong phòng thí nghiệm, nếu chưa xét nghiệm ngay, mẫu phải được bảo quản trong tủ lạnh âm 20 °C (4.2.3).

CHÚ THÍCH: Đồng thời kèm theo Phiếu gửi bệnh phẩm ghi rõ yêu cầu xét nghiệm và những thông tin về dịch tễ, các biểu hiện triệu chứng, bệnh tích của bệnh.

6.2.3. Chuẩn bị mẫu

Lấy 1 g mẫu bệnh phẩm (6.2.1) gồm dây thần kinh, gan, lách, nang lông cắt nhỏ, rồi nghiền với dung dịch PBS (3.2.1) theo tỉ lệ 1 : 10 thành huyễn dịch trong cối chày sứ (4.2.6). Ly tâm (4.2.4) huyễn dịch ở gia tốc 3 000 g trong thời gian 5 min rồi hút lấy dịch nổi để tách chiết ADN cho phản ứng realtime PCR.

...

...

...

6.2.4.1. Tách chiết ADN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.4) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: sử dụng kít tách chiết QIAGEN RNeasy Blood tissue (Cat. No. 69506)1) (xem Phụ lục B).

6.2.4.2. Chuẩn bị mồi

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.2.1) theo phương pháp realtime PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của virus gây bệnh Marek sử dụng cặp mồi và mẫu dò (primers và probe) (3.2.6) được nêu trong Bảng 3.

Mồi và mẫu dò được chuẩn bị như sau:

- Chuẩn bị mồi gốc và mẫu dò gốc: mồi và mẫu dò ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.2.2) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.7) để hoàn nguyên mồi và mẫu dò ở nồng độ 100 mM làm mồi gốc và mẫu dò gốc;

- Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 mM: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.8) (20 ml mồi gốc và 80 ml nước (3.2.8)).

- Chuẩn bị mẫu dò sử dụng ở nồng độ 6 mM: pha loãng mẫu dò gốc bằng nước (3.2.8) (6 ml mồi gốc và 94 ml nước (3.2.8)).

...

...

...

Mẫu dò, mồi

Trình tự từ 5’ đến 3’

Mẫu dò

FAM-AGACCCTGATGATCCGCATTGCGACT-TAMRA

Mồi xuôi

GGTCTGGTGGTTTCCAGGTGA

Mồi ngược

GCATAGACGATGTGCTGCTGA

6.2.4.3. Tiến hành phản ứng

...

...

...

Sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng kít nhân gen của hãng Invitrogen Platinum One - step qPCR SuperMix - UDG (Cat. No. 11730-017) 2), thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng 4.

Bảng 4 - Thành phần phản ứng

Thành phần

Thể tích,

ml

Dung dịch đệm 2 X (2 X Reaction buffer)

12,5

Mồi/ mẫu dò

...

...

...

Nước tinh khiết không có nuclease

6,0

Tổng thể tích

20,0

Chuyển 20 ml hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng.

- Mẫu kiểm chứng dương: cho 5 ml mẫu ADN có giá trị Ct đã biết trước vào ống phản ứng.

- Mẫu kiểm chứng âm: cho 5 ml nước tinh khiết không có nuclease vào ống phản ứng.

- Mẫu bệnh phẩm: cho 5 ml mẫu ADN (phụ lục B) vào ống phản ứng.

CHÚ Ý:

...

...

...

- Mẫu và nguyên vật liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

Tiến hành phản ứng bằng máy realtime PCR (4.2.1) đã được cài đặt chu trình nhiệt nêu trong bảng 5.

Bảng 5 - Chu trình nhiệt phản ứng

Nhiệt độ

Thời gian

Số chu kỳ

95 °C

2 min

1

...

...

...

10 s

40

60 °C

30 s

40

6.2.5. Đọc kết quả

Đọc kết quả bằng máy reatime PCR (4.2.1) dựa trên giá trị Ct (Ct là thời điểm máy đọc realtime PCR ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền)

Điều kiện phản ứng được công nhận: mẫu kiểm chứng dương tính có giá trị Ct biết trước (± 2 Ct), mẫu kiểm chứng âm tính không có Ct;

Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính; mẫu không có Ct được coi là âm tính; mẫu có giá trị 35 < Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ;

...

...

...

7. Kết luận

Gà được xác định mắc bệnh Marek khi có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể đặc trưng của bệnh và dương tính với một trong hai phương pháp xét nghiệm quy định trong tiêu chuẩn này.

Phụ lục A

(Quy định)

Chuẩn bị dung dịch muối đệm phosphat (PBS)

A.1. Thành phần

Natri hydrophosphat (Na₂HPO₄) 9,47 gm

Kali dihydrophosphat (KH₂PO₄) 9,08 gm

...

...

...

A.2. Chuẩn bị

Hòa tan natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 900 ml nước cất. Chỉnh pH đến 7,0 bằng axit clohydric.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng PBS thương mại và pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ADN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Qui trình tách chiết ADN sử dụng kít QIAGEN RNeasy Blood & Tissue kit (Cat. No. 69506) như sau:

...

...

...

- Dung dịch AW1: thêm 125 ml etanol tuyệt đối (3.2.2) vào 95 ml dung dịch AW1 đậm đặc;

- Dung dịch AW2: thêm 160 ml etanol tuyệt đối (3.2.2) vào 66 ml dung dịch AW2 đậm đặc.

B.2. Cách tiến hành

- Cho 20 ml protease vào ống 1,5 ml;

- Chuyển 200 ml dịch mẫu (dịch nổi xử lý ở 6.2.3) vào ống 1,5 ml;

- Thêm 200 ml dung dịch AL (lysis buffer) vào ống. Lắc bằng máy lắc (4.2.5) trong 15 s, sau đó ly tâm (4.2.4) với gia tốc 3 000 g trong 1 min;

- Ủ ở nhiệt độ 56 °C trong 10 min, sau đó ly tâm (4.2.4) với gia tốc 3 000 g trong 1 min;

- Cho 200 ml etanol tuyệt đối (3.2.2) vào ống. Lắc bằng máy lắc (4.2.5) trong 15 s, sau đó ly tâm với gia tốc 3 000 g trong 1 min;

- Chuyển 620 ml dung dịch mẫu đã tách chiết vào cốc lọc (spin column) với ống thu (collection tube);

...

...

...

- Thêm 500 ml dung dịch AW1 vào cột lọc có ống thu ở dưới;

- Ly tâm (4.2.4) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Cho cột lọc vào ống thu mới;

- Thêm 500 ml dung dịch AW2 vào cột lọc có ống thu ở dưới;

- Ly tâm (4.2.4) với gia tốc 20 000 g trong 3 min ở nhiệt độ phòng;

- Chuyển cột lọc sang ống ly tâm 1,5 ml;

- Nhỏ 200 ml dung dịch AE vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min;

- Ly tâm (4.2.4) với gia tốc 6 000 g trong 1 min;

- Chuyển ADN đã thu sang ống 1,5 ml mới;

...

...

...

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Aly M.Fadly, 2008, Disease of poultry, 12th, Blackwell Publishing, p.449 - p.616.

[2] Butter C., Staines K., Baaten B., Smith L., Davison F. T. (2007) Route of challenge is critical in determining the clinical outcome of infection with a very virulent oncogenic herpesvirus, Marek’s disease virus, Avian Pathology (April 2007) 36(2), 9399.

[3] Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals, 2010, OIE, Chapter 2.3.13. Marek’s disease.

[4] Venugopal Nair, Richard C. Jones, R.E. Gough, 2008, Poultry disease, 6^th Edition, Saunders Elserier, p.258 - p.267.

[5] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh, Đỗ Ngọc Thúy, 2012. Giáo trình bệnh truyền nhiễm thú y. NXB Đại học Nông nghiệp.

[6] L.N. Payne & K. Venugopal, “Neoplastic diseases: Marek’s disease, avian leukosis and reticuloendotheliosis”, Rev. sci. tech. Off. int. cpiz., 2000,19 (2), 544-564. Available at: http://www.oie.int/doc/ged/D9316.PDF

[7] Marek’s Disease in Poultry. Available at: http://www.merckmanuals.com/vet/pourtry/neoplasms/mareks_disease_in_poultry.html

...

...

...

1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

2) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.