Cặp mồi dùng để khuếch đại đoạn gen của T. annulata có kích thước sản phẩm 785 bp

Mồi được chuẩn bị như sau:

- Chuẩn bị mồi gốc: mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.3.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.8) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 mM làm mồi gốc.

- Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 mM, pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.10) (20 ml mồi gốc và 80 ml nước).

6.2.4.3  Tiến hành phản ứng

Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (6.2.4.2).

Sử dụng kít nhân gen (3.2.2) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng bộ kít Taq PCR master mix, Qiagen (Cat. No. 201443)2)

Thành phần cho một phản ứng được nêu trong Bảng 2.

...

...

...

Thành phần

Thể tích (ml)

Taq PCR Master Mix kít

12,5

Mồi xuôi, 20 mM

0,5

Mồi ngược, 20 mM

0,5

Nước tinh khiết không có nuclease

...

...

...

Tổng thể tích

20

Chuyển 20 ml hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu kiểm chứng dương: cho 5 ml mẫu ADN có kích cỡ sản phẩm đã biết vào ống phản ứng;

- Mẫu kiểm chứng âm: cho 5 ml nước (3.2.10) vào ống phản ứng;

- Mẫu bệnh phẩm: cho 5 ml mẫu ADN bệnh phẩm (6.2.4.1) vào ống phản ứng.

CHÚ THÍCH:

- Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu bệnh phẩm, mẫu kiểm chứng dương và mẫu kiểm chứng âm;

- Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

...

...

...

Bảng 3 - Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Nhiệt độ

Thời gian

Số chu kỳ

94 °C

3 min

1

94 °C

1 min

...

...

...

60 °C

1 min

72 °C

1 min

40

72 °C

10 min

1

6.2.4.4  Điện di

...

...

...

Pha agarose (3.2.4) với nồng độ agarose từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.5) (từ 1,5 gram đến 2 gram agarose với 100ml TAE 1X hoặc TBE 1X) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc cho tan.

Sau đó đun dung dịch agarose sôi, để nguội đến khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 ml chất nhuộm màu (3.2.6) cho 100 ml thạch. Lắc nhẹ để chất nhuộm màu tan đều, tránh tạo bọt.

Tiến hành đổ dung dịch agarose vào khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bản gel dày quá 0,8 cm.

Khi bản agarose đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản gel.

Chuyển bản gel vào bể điện di (4.3.5), đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) (3.2.5) (cùng loại với dung dịch agarose đã đun) vào bể điện di cho tới khi ngập bản gel.

Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha agarose (ví dụ: Sybr safe ADN gel stain3)) và sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

6.2.4.4.2  Chạy điện di

Chuyển 2 ml Loading dye 6X (3.2.7) vào 8 ml mỗi loại mẫu (kiểm chứng âm, dương) (6.2.4.3) và sản phẩm PCR (6.2.4.3) ra trộn đều và cho vào các giếng trên bản gel (6.2.4.4.1).

Đưa gel vào chạy điện di trong bộ điện di (4.3.5) với thang chuẩn ADN (marker) (3.2.9) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Chuyển 10 ml thang chuẩn ADN (marker) (3.2.9) vào một giếng trên bản gel.

...

...

...

Bản gel sau khi điện di xong được lấy ra và đọc kết quả trên máy đọc gel (blue light transilluminator) (4.3.6).

6.2.5  Đọc kết quả

Đặt bản gen lên trên máy đọc gel (4.3.6):

- Mẫu dương tính có hiển thị vạch sản phẩm giống như mẫu kiểm chứng dương và có kích thước 785 bp với điều kiện mẫu kiểm chứng âm không có vạch sản phẩm xuất hiện;

- Mẫu âm tính giống mẫu kiểm chứng âm và không có vạch sản phẩm xuất hiện;

- Mẫu nghi ngờ hiển thị vạch sản phẩm không rõ nét hoặc hiển thị nhiều hơn 1 vạch sản phẩm. Trường hợp này cần xét nghiệm lại hoặc sử dụng các phương pháp khác để khẳng định.

6.3  Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể Theileria

6.3.1  Lấy mẫu

Sử dụng xylanh 5 ml và kim tiêm 20 G (hoặc 18 G) vô trùng, lấy từ 1,5 ml đến 2 ml máu ở tĩnh mạch cổ hoặc động mạch đuôi của trâu bò nghi mắc bệnh Theileria. Sau khi lấy, rút pittong lùi ra để tạo khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống nghiệm vô trùng), ghi ký hiệu mẫu trên xylanh hoặc ống nghiệm rồi đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ bình thường, tránh ánh nắng trực tiếp.

...

...

...

Tất cả các mẫu bệnh phẩm đều được bảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C) chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 48 h. Trong trường hợp chưa xét nghiệm ngay, mẫu huyết thanh phải được ly tâm, chắt lấy phần huyết thanh sang ống khác, bảo quản trong tủ lạnh âm sâu (4.1.1)

6.3.3  Chuẩn bị mẫu

Chắt huyết thanh từ xylanh (6.3.1) sang ống nghiệm vô trùng, kể từ lúc lấy máu đến lúc chắt huyết thanh không quá 24 h, ghi ký hiệu của mẫu lên ống chứa huyết thanh.

6.3.4  Cách tiến hành

VÍ DỤ: dùng bộ kit phát hiện kháng thể Theileria ở trâu bò của hãng SVANOVA4)

6.3.4.1  Chuẩn bị nguyên liệu

- Dung dịch đệm: pha loãng dung dịch PBS - Tween 20 X với nước cất theo tỷ lệ 1/20 (cho 25 ml PBS Tween 20 X vào 475 ml nước cất), lắc đều. Bảo quản dung dịch đệm ở nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C;

- Dung dịch kháng kháng thể bò: pha loãng dung dịch kháng kháng thể bò với 11,5 ml dung dịch đệm (pha xong dùng ngay). Sau khi pha loãng bảo quản ở âm 20 °C. Dung dịch kháng kháng thể bò đông tan tối đa 3 lần;

- Pha loãng mẫu kiểm chứng (âm, dương) và mẫu bệnh phẩm (6.3.3) với dung dịch đệm theo tỷ lệ 1/100 (cho 5 ml mẫu kiểm chứng hoặc mẫu bệnh phẩm vào 495 ml dung dịch đệm).

...

...

...

- Các thuốc thử để ở nhiệt độ phòng từ 18 °C đến 25 °C trước khi sử dụng;

- Nhỏ 100 ml mẫu kiểm chứng (âm, dương) đã pha loãng (6.3.4.1) vào các giếng được chọn (mỗi mẫu thực hiện trên 2 giếng, vị trí của mẫu kiểm chứng đã được đánh dấu trong đĩa);

- Nhỏ 100 ml mẫu bệnh phẩm đã pha loãng (6.3.4.1) vào giếng được chọn (mỗi mẫu có thể làm 1 giếng hoặc 2 giếng, tuy nhiên trong trường hợp xác định lại mỗi mẫu nên làm 2 giếng);

- Phủ kín đĩa và ủ ở tủ ấm (4.4.1) trong vòng 30 min;

- Rửa đĩa 4 lần bằng dung dịch đệm (6.3.4.1);

- Nhỏ 100 ml dung dịch kháng kháng thể bò đã pha loãng (6.3.4.1) vào từng giếng;

- Phủ kín đĩa và ủ trong tủ ấm (4.4.1) trong 30 min;

- Rửa đĩa 4 lần bằng dung dịch đệm (6.3.4.1);

- Nhỏ 100 ml dung dịch cơ chất vào mỗi giếng;

...

...

...

- Nhỏ 100 ml dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng;

- Phủ kín đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 min;

- Đọc đĩa ở bước sóng 405 nm bằng máy đọc ELISA (4.4.2) trong vòng 15 min.

6.3.5  Đọc kết quả

- Tính giá trị mật độ quang học (OD) của mẫu kiểm chứng (âm, dương) và mẫu bệnh phẩm.

- Tính tỷ lệ giá trị OD giữa mẫu bệnh phẩm hoặc mẫu kiểm chứng âm với mẫu kiểm chứng dương (PP) theo công thức sau:

PP =

OD mẫu bệnh phẩm hoặc mẫu kiểm chứng âm

x 100

...

...

...

Giá trị mẫu kiểm chứng nằm trong khoảng giới hạn sau:

1) OD của mẫu kiểm chứng dương: trong khoảng từ 1,1 đến 2,3

2) PP của mẫu kiểm chứng âm: nhỏ hơn 15

- Đánh giá kết quả đối với mẫu bệnh phẩm:

1) PP nhỏ hơn 20: mẫu âm tính

2) PP lớn hơn hoặc bằng 20: mẫu dương tính

CHÚ THÍCH: Kít phát hiện kháng thể Theileria không thể phân biệt được kháng thể do nhiễm tự nhiên hay kháng thể do tiêm vắc xin.

6.4  Phương pháp IFAT phát hiện kháng thể Theileria

6.4.1  Lấy mẫu

...

...

...

6.4.2  Bảo quản mẫu

Xem 6.3.2.

6.4.3  Chuẩn bị mẫu

Xem 6.3.3.

6.4.4  Cách tiến hành

6.4.4.1  Chuẩn bị kháng nguyên schizont

6.4.4.1.1  Kháng nguyên schizont trên phiến kính

- Sử dụng kháng nguyên schizont được lấy từ dòng tế bào lympho khi gây nhiễm với T. parva hoặc dòng tế bào đại thực bào khi gây nhiễm với T. annulata;

- Nuôi cấy 200 ml đến 1 lít tế bào nhiễm schizont của loài T. parva hoặc T. annulata ở nồng độ 10⁶ tế bào/ml. Kiểm tra khi thấy 90 % tế bào bị nhiễm là đạt yêu cầu;

...

...

...

- Thu phần cặn, hòa tan với dung dịch PBS (xấp xỉ 100 ml) để có nồng độ 10⁷ tế bào/ml;

- Nhỏ dung dịch pha loãng ở trên thành lớp tế bào mỏng lên phiến kính đã chia thành nhiều ô nhỏ. Khi kiểm tra ở vật kính 40X thấy mỗi ô chứa khoảng 50 tế bào đến 80 tế bào;

- Để khô phiến kính trong không khí, cố định bằng axeton (3.4.2) trong 10 min. Bao gói và bảo quản phiến kính trong tủ lạnh âm sâu (4.1.1), được ít nhất 1 năm.

6.4.4.1.2 Kháng nguyên schizont huyền phù

- Lấy khoảng 500 ml tế bào nhiễm T. parva, T. annulata hoặc T. taurotragi ở nồng độ 10⁶ tế bào/ml đem ly tâm ở gia tốc 200 g bằng máy ly tâm lạnh (4.5.1) trong 10 min ở 4 °C, phần cặn thu được rửa 2 lần trong 100 ml dung dịch PBS lạnh. Có thể kiểm tra các tế bào bằng thuốc nhuộm eosin hoặc trypan blue (3.4.5);

- Phần cặn được hòa tan bằng cách nhỏ từng giọt dung dịch pha loãng (axeton và formaldehyd 0,1 % (3.4.3) theo tỷ lệ 4/1). Đảo nhẹ nhàng và liên tục đến khi đạt huyền phù. Để ổn định các tế bào dạng huyền phù trong tủ lạnh âm sâu (4.1.1) trong 24 h;

- Rửa, ly tâm ở gia tốc 200 g bằng máy ly tâm lạnh (4.5.1) trong 20 min ở 4 °C các tế bào trên 3 lần với dung dịch nước muối sinh lý 0,9 % lạnh. Phần cặn cuối cùng được pha với dung dịch nước muối sinh lý 0,9 % để đạt dạng huyền phù với nồng độ 10⁷ tế bào/ml;

- Kháng nguyên được bảo quản trong dung dịch natri azide 0,2 % (3.4.4) (dung dịch chống phân hủy) ở tủ lạnh (4.1.2) trong 2 tuần hoặc ở tủ lạnh âm sâu (4.1.1) nếu lưu giữ trong thời gian dài.

6.4.4.2  Chuẩn bị kháng nguyên piroplasm

...

...

...

- Kiểm tra máu của con vật gây nhiễm, khi lượng piroplasm trong máu đạt khoảng 10 % thì lấy 100 ml máu từ tĩnh mạch cổ vào ống chống đông chứa heparine hoặc EDTA, lắc nhẹ nhàng;

- Cho thêm 2 lít dung dịch PBS. Ly tâm dung dịch ở gia tốc 500 g bằng máy ly tâm lạnh (4.5.1) trong 10 min ở 4 °C. Bỏ phần dung dịch phía trên thu lấy phần cặn (hồng cầu). Lặp lại bước này 3 lần;

- Sau khi rửa xong, pha loãng hồng cầu trong PBS theo tỷ lệ 1/2. Nhỏ 5 ml dung dịch pha loãng lên từng điểm trên phiến kính;

- Phiến kính được làm khô ở nhiệt độ phòng;

- Cố định phiến kính trong aceton lạnh 4 °C trong 10 min. Bao gói và bảo quản phiến kính ở tủ lạnh âm sâu (4.1.1) ít nhất 1 năm.

CHÚ THÍCH: Do không thể nuôi cấy giai đoạn piroplasm của Theileria spp. nên kháng nguyên piroplasm được lấy từ máu của con vật nhiễm bệnh. Đối với loài T. parva, T. annulata hoặc T. taurotragi, gây nhiễm thực nghiệm trên bê cắt lách bằng cách tiêm dưới da hoặc gây nhiễm trên ve. Đối với loài T. sergenti, T. buffeli, T. orientalis, T. mutan hoặc T. velifera thường gây nhiễm trên bê cắt lách qua đường tĩnh mạch hoặc ve.

6.4.4.2.2  Kháng nguyên piroplasm huyền phù

- Phương pháp này áp dụng cho T. parva;

- Lấy 100 ml máu của con vật gây nhiễm T. parva ở mức cao và làm tương tự như kháng nguyên schizont huyền phù.

...

...

...

- Pha loãng kháng nguyên schizont (6.4.4.1.2) hoặc piroplasm ở dạng huyền phù (6.4.4.2.2) trong dung dịch PBS theo nồng độ từ 1/2 đến 1/16. Ở nồng độ pha loãng nào mà có khoảng 50 tế bào đến 80 tế bào nhiễm schizont hoặc 150 đến 200 hồng cầu nhiễm được nhìn thấy dưới vật kính 40 X thì dùng nồng độ đó để chuẩn hóa kháng nguyên;

- Kiểm tra kháng nguyên với huyết thanh kiểm chứng âm và huyết thanh kiểm chứng dương tính để xác định mức độ dương tính mạnh, trung bình và yếu.

- Đánh giá kết quả:

1) Huyết thanh kiểm chứng dương: có màu huỳnh quang;

2) Huyết thanh kiểm chứng âm: không có màu huỳnh quang.

6.4.4.4  Tiến hành phản ứng IFAT

6.4.4.4.1  Đối với kháng nguyên schizont hoặc piroplasm trên phiến kính

- Bước 1: giải đông phiến kính phủ kháng nguyên ở 4 °C trong 30 min và sau đó để tiếp 30 min ở nhiệt độ phòng;

- Bước 2: vô hoạt mẫu bệnh phẩm trong 30 min trong nồi hấp ướt ở 56 °C;

...

...

...

- Bước 4: nhỏ 25 ml của mỗi huyết thanh pha loãng vào từng điểm kháng nguyên;

- Bước 5: ủ phiến kính trong hộp ẩm ở nhiệt độ phòng trong 30 min;

- Bước 6: rửa bỏ huyết thanh thừa từ phức hợp kháng nguyên - kháng thể ở trên bằng cách nhúng phiến kính liên tiếp trong 2 lọ dung dịch PBS, mỗi lần 10 min;

- Bước 7: cho vào mỗi giếng 20 ml dung dịch kháng kháng thể bò được gắn chất màu huỳnh quang (fluorescein isothiocyanat - FITC) ở độ pha loãng thích hợp (nồng độ pha loãng phụ thuộc vào từng phòng thí nghiệm);

- Bước 8: để phiến kính trong hộp ẩm ở nhiệt độ phòng trong 30 min;

- Bước 9: gắn lamen lên trên phiến kính bằng một giọt dung dịch chứa PBS và glycerol (3.4.6) (tỷ lệ PBS/glycerol là 1/1);

- Bước 10: đọc phiến kính bằng kính hiển vi huỳnh quang (4.5.2).

6.4.4.4.2  Đối với kháng nguyên schizont huyền phù

- Bước 1: giải đông kháng nguyên ở nhiệt độ phòng;

...

...

...

- Bước 3: để khô phiến kính ở nhiệt độ phòng hoặc 37 °C;

- Bước 4: pha loãng huyết thanh kiểm chứng (âm, dương) và mẫu bệnh phẩm ở nồng độ 1/40 trong dung dịch lymphocyte lysate (3.4.7) (195 ml lymphocyte lysate với 5 ml huyết thanh);

- Bước 5: giống từ bước 4 đến bước 10 trong mục 6.4.4.4.1.

6.4.4.4.3  Đối với kháng nguyên piroplasm huyền phù

- Bước 1: đánh tan kháng nguyên piroplasm huyền phù. Pha loãng kháng nguyên theo các bước đã chuẩn hóa ở trên (6.4.4.3);

- Bước 2: để phiến kính khô ở nhiệt độ phòng hoặc 37 °C (4.4.1);

- Bước 3: pha loãng huyết thanh kiểm chứng (âm, dương) và mẫu bệnh phẩm ở nồng độ 1/40 trong dung dịch lymphocyte lysate (3.4.7) (195 ml lymphocyte lysate với 5 ml huyết thanh);

- Bước 4: giống từ bước 4 đến bước 10 trong mục 6.4.4.4.1.

6.4.5  Đọc kết quả

...

...

...

- Mẫu dương tính đối với Theileria khi có màu huỳnh quanh giống với màu của đối chứng dương;

- Mẫu âm tính đối với Theileria khi không có màu huỳnh quang giống với màu của đối chứng âm.

7  Kết luận

Trâu bò được kết luận là mắc bệnh Theileria khi có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của bệnh và có kết quả xét nghiệm kháng nguyên hoặc kháng thể dương tính bằng một trong những phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này.

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị thuốc thử

A.1  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS), 0,01 M, pH 7,0

...

...

...

Natri hydrophosphat (Na₂HPO₄)        9,47 g

Kali dihydrophosphat (KH₂PO₄)        9,08 g

Nước cất                                        900 ml

A.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 900 ml nước cất. Chỉnh pH đến 7,0 bằng axit clohydric.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.2  Dung dịch Giemsa, 10 %

Dung dịch Giemsa (azur-eosin-methylen blue)     1 phần

Dung dịch PBS 0,01 M, pH 7,0 (A.1)                  9 phần

...

...

...

A.3  Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

A.3.1  Thành phần

Dung dịch TBE 10X       100 ml

Nước khử ion               900 ml

A.3.2  Chuẩn bị

Lấy 100 ml dung dịch TBE 10X hòa chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.4  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS), pH 7,2

A.4.1  Thành phần

...

...

...

Kali clorua (KCI)                                   0,2 g

Dinatri hidrophosphat (Na₂HPO₄)         1,15 g

Kali dihidrophosphat (KH₂PO₄)              0,2 g

Nước cất                                        1 000 ml

A.4.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước. Chỉnh pH đến 7,2 bằng axit clohydric.

Bảo quản ở 4 °C.

Phụ lục B

...

...

...

Quy trình tách chiết ADN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Quy trình tách chiết ADN sử dụng kít DNeasy^® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506) như sau:

B.1  Pha dung dịch

- Dung dịch AW 1 (Wash buffer 1): thêm 125 ml etanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) (3.2.5) vào 95 ml dung dịch AW1 đậm đặc;

- Dung dịch AW 2 (Wash buffer 2): thêm 160 ml etanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) (3.2.5) vào 66 ml dung dịch AW2 đậm đặc.

B.2  Cách tiến hành

- Bước 1: ly giải mẫu

• Với mẫu phủ tạng (6.2.3): nhỏ 180 ml dung dịch ATL vào ống 1.5 ml chứa phần dịch nổi sau khi được xử lý (6.1.4.1); nhỏ 20 ml protease K vào ống. Trộn đều bằng máy lắc trộn vortex (4.3.3), ủ ở 56 °C đến khi kết thúc quá trình ly giải, và trộn lại bằng máy lắc trộn vortex (4.3.3) 15 s trước khi chuyển sang bước 2;

...

...

...

- Bước 2: nhỏ 200 ml dung dịch AL vào ống; trộn đều bằng máy lắc trộn vortex (4.3.3) trong 15 s. Ủ mẫu ở 56 °C trong 15 min;

- Bước 3: nhỏ 200 ml etanol từ 96 % đến 100 % (thể tích) vào ống, trộn đều bằng máy lắc trộn vortex (4.3.3).

- Bước 4: chuyển toàn bộ dung dịch trong ống vào cột lọc có ống thu; ly tâm cột lọc và ống thu ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.3.2) trong 1 min, loại bỏ ống thu;

- Bước 5: chuyển cột lọc sang ống thu mới; nhỏ 500 ml dung dịch AW 1, ly tâm ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.3.2) trong 1 min, loại bỏ ống thu;

- Bước 6: chuyển cột lọc sang ống thu mới; nhỏ  500 ml dung dịch AW 2, ly tâm ở gia tốc 20 000 g bằng máy ly tâm (4.3.2) trong 3 min, loại bỏ ống thu;

- Bước 7: chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml hoặc 2 ml sạch;

- Bước 8: nhỏ 50 ml dung dịch AE vào giữa màng cột lọc, ủ 1 min ở nhiệt độ phòng (từ 15 °C đến 25 °C); ly tâm cột lọc và ống 1,5 ml hoặc 2 ml ở gia tốc 6 000 g bằng máy ly tâm (4.3.2) trong 1 min;

- Bước 9: bỏ cột lọc, giữ lại ống 1,5 ml hoặc 2 ml có chứa ADN;

Bảo quản ADN trong tủ lạnh (4.1.2) nếu thực hiện phản ứng PCR ngay hoặc trong tủ lạnh âm sâu (4.1.1) nếu thực hiện phản ứng PCR sau 24 h.

...

...

...

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Kirvar E, llhan T, Katzer F, Hooshmand Rad P, Zweygarth E, Gerstenberg C, Phipps P, Brown CG. Detection of Theileria annulata in cattle and vector ticks by PCR using the Tams1 gene sequences. Parasitology. 2000 Mar, 120(Pt3):245-54.

[2] Theileria parva (T.parva-Ab). Available at:

http://www.veritastk.co.jp/attached/853/lnsert_T_parva_19-2990-00-03.pdf

[3] Phạm Văn Khuê và Phan Lục, 1996, Giáo trình ký sinh trùng thú y. NXB Đại học Nông nghiệp I. 240-242.

[4] Carina M Hall., Joseph D Busch., Glen A Scoles., Kristina A Palma-Cagle., Massaro W Ueti., Lowell S Kappmeyer and David M Wagner, Genetic characterization of Theileria equi infecting horses in North America: evidence for a limited source of U.S. introductions. Parasites & Vectors 2013, 6:35

[5] Doliveira C., Vandermerve M., Habela M., Jacquiet P. & Jongejan F., 1995. Detection of Theileria annulata in blood samples of carrier cattle by PCR. J. Clin. Microbiol. 33, 2665-2669.

[6] Identification of Theileria species and characterization of Theileria parva stocks. Available at: http://www.fao.org/wairdocs/ilri/x5549e/x5549e0t.htm

1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

...

...

...

3) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

4) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.