Hình 3: Cành héo do bệnh khô cành cam quýt P. tracheiphila

(Nguồn: PaDIL, 2012)

Hình 4: Chết ngọn do bệnh khô cành cam quýt P. tracheiphila

(Nguồn: PaDIL, 2012)

Hình 5: Vết bệnh có chứa các quả cành nấm P. tracheiphila

(Nguồn: PaDIL, 2012)

Hình 6: Triệu chứng bó mạch hóa hồng của bệnh khô cành cam quýt

...

...

...

4. Đặc điểm hình thái bào tử nấm P. tracheiphila

Quả cành hình cầu, hơi kéo dài thành một cổ ngắn có miệng nhỏ, màu đen đường kính 60-165x45-150mm (hình 7, phụ lục 1). Các bào tử phân sinh nằm trong quả cành dạng đơn bào, kích thước 0,5-1,5x2-4mm.

Bào tử phân sinh được sinh ra từ các tế bào sinh bào tử. Bào tử phân sinh (phialoconidia) đơn bào thường có 1 đến 3 giọt dầu màu trong suốt, dạng thẳng hoặc cong, đầu bào tử tròn kích thước 1,5-3x3-8mm thường được sản sinh bởi các tế bào sinh bào tử ở trên các sợi nấm tự do phát triển ở vùng gỗ trên thân lộ ra ngoài, phần mô bị thương hoặc trong mạch dẫn (hình 8, phụ lục 1).

Bào tử đính dạng chồi (blastoconidia) có dạng trứng hoặc dạng quả lê được sinh ra từ mạch dẫn cây kí chủ và trên môi trường nuôi cấy nhân tạo lỏng.

Hình 7: Quả cành của nấm P. tracheiphila

(Nguồn: S. Grasso,1992)

Hình 8: Bào tử (phialoconidia) của P. tracheiphila

...

...

...

Hình 9: Sắc tố đỏ trên đĩa khi đặt các lát cành nhiễm bệnh khô cành trên môi trường PDA

(Nguồn: PaDIL, 2009)

Phụ lục 2.

(quy định)

Quy trình giám định bệnh khô cành cam quýt bằng PCR

1. Tách chiết DNA tổng số

1.1. Tách chiết DNA tổng số từ mô cây (mô gỗ, cành, lá)

Nghiền 500mg mô cây bằng chày và cối sứ trong nitơ lỏng. Chuyển 100mg mô nghiền vào ống eppendorf chứa 450ml dịch chiết cây.Trộn đều bằng máy trộn dịch. Ủ ở 65^oC trong 1 giờ.Thêm vào ống 300ml NaCI 6M và trộn đều bằng máy trộn dịch. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút và thu dịch nổi vào ống mới. Thêm phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) vào ống với một thể tích tương đương và trộn đều bằng máy trộn dịch. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút thu dịch nổi. Thêm chloroform vào ống với một thể tích tương đương và trộn đều bằng máy trộn dịch. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút thu dịch nổi. Thêm isopropanol vào ống một thể tích tương đương. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút thu tủa DNA loại bỏ dịch. Thêm vào ống 100ml Ethanol 70% để rửa tủa DNA. Loại bỏ Ethanol để tủa DNA khô tự nhiên trong 10 phút. Hòa tan tủa DNA trong 100ml TE pH8 bảo quản ở 4^oC.

...

...

...

Dùng kim khêu nấm vô trùng chuyển sợi nấm từ đĩa nuôi cấy vào ống eppendorf. Nghiền nhỏ nấm bằng chày nhựa vô trùng trong nitơ tỏng. Chuyển hỗn hợp nghiền vào ống eppendorf mới đã chứa 400ml dịch chiết nấm. Trộn đều bằng máy trộn dịch. Thêm vào ống 8ml Proteinase K 20mg/ml lắc nhẹ. Ủ ở 65^oC trong 2 giờ hoặc qua đêm.Thêm vào 300ml NaCI 6M trộn bằng máy trộn dịch trong 30 giây. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30 phút thu dịch phía trên. Thêm isopropanol vào ống với một thể tích tương đương lắc nhẹ. Ủ ở -20^oC trong 1 giờ hoặc lâu hơn. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút thu tủa DNA loại bỏ dịch. Thêm vào 100ml Ethanol 70% để rửa tủa DNA. Loại bỏ ethanol, để tủa DNA khô tự nhiên trong 10 phút. Hòa tan tủa DNA trong 100ml TE pH8 bảo quản ở 4^oC.

2. Nhân gen bằng máy PCR.

Đoạn mồi sử dụng

Pt-FOR2 (5'-GGATGGGCGCCAGCCTTC-3')

Pt-REV2 (5'-GCACAAGGGCAGTGGACAAA-3')

Master mix: 25ml mỗi phản ứng

1.5 mM MgCI2,

50 mM KCl;

200 mM mỗi loại dATP, dCTP, dGTP và dTTP

...

...

...

10 ng DNA tách chiết

0.8 ml Taq DNA polymerase

3. Chu trình nhiệt

94^oC trong 5 phút

94^oC trong 30 giây

Lặp lại 30 chu kì

65^oC trong 60 giây

72^oC trong 90 giây

72^oC trong 5 phút

...

...

...

Sản phẩm nhân gen được điện di trong gel agarose 1,5% trong 2,5 giờ hiệu điện thế 3,3 V/cm trong dung môi TAE. Nhuộm gel bằng ethidium bromide và quan sát dưới đèn UV

Mẫu dương tính cho ra đoạn gen kích thước 378bp

5. Thành phần dịch chiết dùng cho PCR

5.1. Thành phần dịch chiết cây

0,4 M NaCI; 10 mM Tris-HCI pH 8,0; 2,0 mM EDTA pH 8,0; 400 mg/mL proteinase K; 2% SDS

5.2. Thành phần dịch chiết nấm

400 mM NaCI; 10 mM Tris-CI pH 8,0; 2 mM EDTA; 20 g/l SDS

Phụ lục 3.

...

...

...

1. Môi trường PDA

Cân 200g khoai tây

Cắt thành những hình lập phương 1x1x1 cm

Đun trong 1 giờ.

Lọc qua vải lọc thu nước trong.

Thêm 20g dextrose.

Thêm 15 g Agar.

Thêm nước cất cho đủ 1 lít.

2. Môi trường CPA

...

...

...

Lấy mỗi loại 20g đun trong nước cất khoảng 1 giờ

Lọc qua vải lọc chỉ thu lại phần nước trong

Thêm vào 15g agar

Thêm nước cất cho đủ 1 lít

Phụ lục 4.

(quy định)

Mẫu phiếu kết quả giám định

Cơ quan Bảo vệ
và Kiểm dịch thực vật
………………………………………..

...

...

...

……….. ngày …. tháng …. năm 20…..

PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH

Bệnh khô cành cam quýt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili- là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam

1. Tên hàng hóa

:

2. Nước xuất khẩu

:

...

...

...

:

4. Phương tiện vận chuyển

:

Khối lượng:

5. Địa điểm lấy mẫu

:

6. Ngày lấy mẫu

:

7. Người lấy mẫu

...

...

...

8. Tình trạng mẫu

:

9. Ký hiệu mẫu

:

10. Số mẫu lưu

:

11. Người giám định

:

12. Phương pháp giám định: Theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01 - 173 : 2014/BNNPTNT về "Quy trình giám định bệnh khô cành cam quýt Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili- là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam".

...

...

...

Tên khoa học: Phoma tracheiphila (Pertri) Kantachveli & Gikachvili

Lớp: Dothideomycetes

Bộ: Pleosporales

Họ: Pleosporaceae

Là dịch hại kiểm dịch thực vật thuộc danh mục dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam.

TRƯỞNG PHÒNG KỸ THUẬT
(hoặc người giám định)
(ký, ghi rõ họ và tên)

THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ
(ký, ghi rõ họ và tên, đóng dấu)

...

...

...