...

...

...

2.4. Phương pháp làm tiêu bản tuyến trùng

2.4.1. Dung dịch bảo quản tuyến trùng

Tuyến trùng ký sinh thực vật thu được từ một trong các phương pháp tách lọc nêu trên được đưa vào một trong ba loại dung dịch dưới đây để bảo quản tuyến trùng.

* Chú ý: để tiêu bản tuyến trùng giữ được hình dáng đặc trưng, trước khi cho vào dung dịch bảo quản nên xử lý nhiệt tuyến trùng bằng nước ở nhiệt độ 70–80^oC trong 5 phút.

- Dung dịch 1: Formalin

Dung dịch Formadehyde 4%.

- Dung dịch 2: Formalin - glycerol (FG)

Formalin (40%) Formaldehyde): 10ml

Glycerol:                                                           01ml

...

...

...

- Dung dịch 3: TAF

Triethanolamine:                                                02ml

Formalin (40% formaldehyde):                           07ml

Nước cất:                                                         91ml

2.4.2. Phương pháp xử lý và làm tiêu bản tuyến trùng

2.4.2.1.  Phương pháp xử lý tuyến trùng

- Dung dịch xử lý:

Dung dịch 1:     Cồn (96%)                     20ml

                        Glycerol                        01ml

...

...

...

Dung dịch 2:     Cồn (96%)                     95ml

                        Glycerol                        05ml

- Cách tiến hành:

Gắp tuyến trùng từ dung dịch bảo quản vào chén thuỷ tinh có chứa 0,5ml dung dịch xử lý (dung dịch 1). Đặt chén này trong bình hút ẩm đậy kín có chứa 1/10 thể tích cồn 96^o. Bình hút ẩm được đặt trong tủ ấm ở điều kiện nhiệt độ 40^oC với thời gian tối thiểu là 12 giờ.

Lấy chén thuỷ tinh ra khỏi bình hút ẩm, thêm dung dịch 2. Đậy nắp một phần miệng chén để cồn bay hơi từ từ. Chén thuỷ tinh có chứa tuyến trùng tiếp tục giữ trong tủ ấm ở  40^oC. Sau 2-3 giờ bổ sung thêm dung dịch 2 vào chén thuỷ tinh cho gần đầy, làm lại 2 – 3 lần. Sau khi tuyến trùng chỉ còn lại trong Glycerol có thể sử dụng làm tiêu bản được.

Hoặc đặt chén thuỷ tinh chứa tuyến trùng trong glycerol nguyên chất trên trong bình hút ẩm có chứa vôi. Bảo quản lâu dài để làm tiêu bản cố định.

2.4.2.2.  Phương pháp làm tiêu bản

Lấy lam kính sạch và làm vòng parapin hoặc sáp ong (đuờng kính khoảng 1cm) trên lam kính. Cho 1 giọt glycerol nguyên chất vào giữa vòng parapin hoặc sáp ong. Dùng kim gắp, gắp tuyến trùng (đã xử lý trong dung dịch cố định) đặt vào giữa giọt glycerol, chỉnh cho các cá thể tuyến trùng nằm cùng một hướng. Đậy lamen và đặt lam kính trên bàn nhiệt cho parapin hoặc sáp ong tan chảy. Nhấc nhanh lam kính và đặt ra chỗ mát. Gắn keo bảo vệ.

2.4.2.3. Phương pháp làm tiêu bản phần sau bào nang (lỗ sinh dục và lỗ hậu môn)

...

...

...

Vớt ra, quan sát dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 40 – 70 lần và dùng dao lam cắt lấy phần thân có hậu môn (xem hình 2)

Hình 2. Cách cắt tiêu bản phần thân có hậu môn

Đặt phần thân có hậu môn lên lam kính, nhỏ vài giọt glycerol để quan sát dưới kính hiển vi.

2.5. Trình tự giám định

2.5.1. Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi có độ phóng đại từ 40 – 1.000 lần (40x – 1.000x) các chỉ tiêu sau

- Hình dạng và đo chiều dài kim hút, đếm số vòng ở vùng môi, quan sát gai giao cấu và đuôi của tuyến trùng đực

- Hình dạng và đo kích thước của tuyến trùng cái

- Hình dạng và đo kích thước của ấu trùng

...

...

...

- Màu sắc, nếp nhăn  hoặc các đường vân, vị trí lỗ sinh dục của bào nang.

- Đặc điểm lỗ hậu môn

2.5.2. So sánh đặc điểm đã quan sát và kết quả đã đo đếm được với đặc điểm hình thái và giải phẫu của tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 và Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 (phụ lục A) để kết luận.

III. THẨM ĐỊNH KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH VÀ BÁO CÁO

Sau khi khẳng định kết quả giám định tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 và Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam, đơn vị giám định phải gửi báo cáo về Cục Bảo vệ thực vật kèm theo phiếu kết quả giám định (xem phụ lục B).

Đối với đơn vị lần đầu tiên giám định và phát hiện được tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 và Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 phải gửi mẫu hoặc tiêu bản về Trung tâm Giám định kiểm dịch thực vật để thẩm định.

Đơn vị giám định phải đảm bảo thời gian lưu mẫu theo quy định kỹ thuật hiện hành.

A.1. Thông tin về dịch hại

...

...

...

A.1.1.1. Phân bố và ký chủ

- Phân bố: Các vùng trồng khoai tây trên thế giới: Châu Phi: Algeria, Tunisia; Bắc Mỹ: Canada; Trung Mỹ và vùng Caribe: Panama; Nam Mỹ: Bolivia, Colombia, Ecuador, Peru, Chile,  Venezuela; Châu Á: India, Pakistan, Turkey; Châu Âu: France, Germany, Italia, Belgium, Denmark, Netherland, Porturgal, Libya, Luxembourg, Spain, Austria, Yugoslavia, Swetzerland,  Iceland, Ireland; Châu Đại Dương: NewZealand

- Ký chủ: Khoai tây và cây họ cà: cà chua, cà tím,..

A.1.1.2. Tên khoa học và vị trí phân loại:

- Tên khoa học: Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975

Tên tiếng Việt: Tuyến trùng bào nang khoai tây

Tên khác : Heterodera pallida Stone, 1973

- Vị trí phân loại:

Lớp: Nematoda

...

...

...

Bộ phụ: Tylenchina

Họ: Heteroderidae

A.1.2.  Tuyến trùng bào nang Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975

A.1.2.1. Phân bố và ký chủ

- Phân bố:Các vùng trồng khoai tây trên thế giới

Châu Phi: Algeria, Tunisia, Morocco, South Africa, Libya; Bắc Mỹ: Canada, Mexico, USA; Trung Mỹ và vịnh Caribe: Costarica, Panama; Nam Mỹ: Bolivia, Colombia, Ecuador, Peru, Chile,  Venezuela; Châu Á¸: India, Israel, Japan (Hokkaido), Pakistan, Philippine, Lebanon; ChâubÂu : France, Germany, Italia, Belgium, Denmark, Netherland, Portugal, Libya, Luxembourg, Spain, austria, Swetzerland, UK, Yugoslavia, Iceland, Ireland, Poland, Bulgari, Cezch Republic,  Slovakia, Finland, Hungary; Châu Đại Dương: NewZealand, Australia.

- Ký chủ: Khoai tây và cây họ cà: cà chua, cà tím,.

A.1.2.2. Tên khoa học và vị trí phân loại

- Tên khoa học: Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975

...

...

...

- Tên khác (synonym):  

Heterodera schachtii solani Zimmerman, 1927

Heterodera schachtii rostochiensis Wollenweber, 1923

Heterodera (Globodera) rostochiensis Wollenweber,1923 (Skarbilovich, 1959)

Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Mulvey & Stone, 1976

Heterodera rostochiensis Wollenweber, 1923      

- Vị trí phân loại:

Ngành:Giun tròn

Lớp:Nematoda

...

...

...

 Bộ phụ: Tylenchina

Họ: Heteroderidae

A.2. Đặc điểm nhận dạng

A.2.1. Đặc điểm chung

Trứng: Hình bầu dục dài, nằm trong bào nang

Tuyến trùng non: Hình giun, trong quá trình phát triển lên trưởng thành: con đực vần giữ nguyên hình giun, con cái sẽ phình to dần thành hình cầu. Đầu nhô lên, kitin hoá mạnh, chia 6 thuỳ. Kim hút to khoẻ. Có 4 đường bên. Mầm cơ quan sinh dục nằm khoảng 60% chiều dài cơ thể tính từ đỉnh đầu. Đuôi thon, mút đuôi tròn.

Trưởng thành: Con cái: Con cái có dạng hình cầu, mầu trắng hoặc mầu kem. Khung đầu yếu, chia 6 thuỳ. Kim hút đều nhau giữa phần chóp và phần hình trụ. Diều giữa to khỏe. Các cặp buồng trứng lớn, kéo dài trong khoang cơ thể thường chiếm chỗ của tuyến thực quản. Lỗ bài tiết nằm ở chân cổ. Lỗ sinh dục dạng khe nằm ở vùng sinh dục (là vết lõm nằm đối diện với cổ qua phần thân) và được bao quanh bằng các lớp biểu bì mỏng trong mờ và có các nhú.

Bào nang: hình cầu, có lớp vỏ bền và cứng mầu nâu vàng đến nâu sậm hoặc nâu đỏ, có vai trò như một túi bảo vệ trứng bên trong. Lỗ sinh dục(vulva) là đặc điểm hình thái quan trọng để giám định. Đặc điểm của lỗ sinh dục thường bị mất, chỉ còn lại là một lỗ khi bào nang đã thành thục.

Con đực: hình giun, dài hơn 1mm. Đuôi tròn, ngắn, Khung đầu kitin hoá mạnh, có 6 thuỳ. Kim hút khỏe. Diều giữa tròn, van diều giữa hình bán nguyệt. Tinh hoàn đơn. Gai giao cấu cong, gai đệm nhỏ.

...

...

...

Khoảng cách từ đường viền lỗ sinh dục đến lỗ hậu môn (mm)

Đường kính lỗ sinh dục (mm)

Ghi chú:

L: Tổng chiều dài cơ thể (mm hoặc mm)

a: chiều dài cơ thể (mm)/chiều rộng lớn nhất (thường là vị trí vulva) (mm)

b: chiều dài cơ thể (mm)/chiều dài từ đỉnh đầu cơ thể đến van ruột-thực quản (mm)

c: chiều dài cơ thể (mm)/chiều dài đuôi (mm)

V (%): chiều dài cơ thể từ đỉnh đến vulva (mm)x 100/chiều dài cơ thể (mm)

T (%): chiều dài từ lỗ huyệt đến đỉnh của tinh hoàn (mm) x 100/chiều dài cơ thể (mm)

...

...

...

- Con cái: Hình cầu, đường kính 0,5 – 0,8mm. Số đường vân trên biểu bì từ lỗ hậu môn đến lỗ sinh dục = 12,5 ± 3,1

- Trứng: Hình bầu dục dài, kích thước 102 x 42μ

- Bào nang: hình cầu, màu nâu, nhỏ như đầu đinh ghim, trên bề mặt có những đường vân do những chấm con hợp lại. Lỗ sinh dục và lỗ hậu môn bé. Lỗ sinh dục nằm trên một giao điểm của các đường vân không tạo thành hình chữ V. Tỉ số Granek = 2,1± 0,9. 

- Con đực: Hình giun, dài 1mm, kim hút khoẻ, dài 27 - 28μ. Gốc chân kim hút to, thô và nhô về phía trước (hình 3). Đầu tuyến trùng thuôn múp, vùng môi có 6 – 8 vòng, có gai giao cấu, đuôi tròn ngắn.

Hình 1: Phần sau bào nang tuyến trùng Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 (lỗ hậu môn, lỗ sinh dục, đường vân)

A.2.3. Đặc điểm nhận dạng tuyến trùng bào nang Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I của Việt Nam

- Con cái: Hình cầu, đường kính 0,5-0,8mm. Số đường vân trên biểu bì từ lỗ hậu môn đến lỗ sinh dục = 21,6 ± 3,5.

- Trứng: Hình bầu dục dài, kích thước 102 x 42μm

...

...

...

- Con đực: Hình giun, dài 1mm, kim hút khoẻ, dài 27 - 28μ. Gốc kim hút nhỏ và tròn (hình 3). Đầu tuyến trùng luôn múp, vùng môi có 6 – 8 vòng, có gai giao cấu, đuôi tròn ngắn.

Hình 2: Phần sau bào nang tuyến trùng Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 (lỗ hậu môn, lỗ sinh dục, đường vân)

Hình 3: Hình dạng kim hút của tuyến trùng bào nang

Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 và Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975

(Nguồn: Stone, A. R.,1973)

Lưu ý:

Thông thường số lượng cá thể nghiên cứu phải đảm bảo là 30 (n=30). Trong trường hợp số lượng cá thể ít hơn hoặc chỉ phát hiện duy nhất một cá thể có các đặc điểm phân loại như trên có thể cho phép kết luận là  tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 và Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 (chỉ áp dụng đối với các đơn vị đã từng giám định được tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 và Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975)

...

...

...

....................................................

................................................

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
----------------

...... ngày ... tháng ... năm 20…..

Tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975  hoặc Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 là dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam

1.    Tên hàng hoá                                      :

2.    Nước xuất khẩu                                   :

...

...

...

4.    Phương tiện vận chuyển                      :                               Khối lượng:

5.    Địa điểm lấy mẫu                                 :

6.    Ngày lấy mẫu                                      :

7.    Người lấy mẫu                                    :

8.    Tình trạng mẫu                                     :

9.    Ký hiệu mẫu                                        :

10. Số mẫu lưu                                         :

11.  Người giám định                                 :

12.  Phương pháp giám định: Theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về “Quy trình giám định tuyến trùng bào nang Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens, 1975 và Globodera rostochiensis (Wollenweber, 1923) Behrens, 1975 là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I của Việt Nam”.

...

...

...

Tên khoa học:

Bộ: Tylenchida

Bộ phụ: Tylenchina

Họ: Heteroderidae

Là dịch hại kiểm dịch thực vật nhóm I thuộc danh mục dịch hại kiểm dịch thực vật của Việt Nam.

    TRƯỞNG PHÒNG KỸ THUẬT                                               THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ

          (hoặc người giám định)                                                (ký, ghi rõ họ và tên, đóng dấu)

           (ký, ghi rõ họ và tên)