Hòa tan tím tinh thể trong etanol và hòa tan amoni oxalat trong nước. Trộn 2 dung dịch này với nhau, lắc đều.

A.1.2. Dung dịch fuscin gốc

Basic fuchsin (CH₁₉O)

1 g

Etanol 95%

10 ml

Phenol (C₆H₆O)

5 g

Nước

...

...

...

Pha loãng dung dịch theo tỉ lệ 1:10 (phần thể tích) với nước khi sử dụng.

A.1.3. Dung dịch lugol

Kali iodua

2 g

Iodua tinh thể

1 g

Nước

200 ml

Nghiền kali iodua và iodua tinh thể, cho nước vào từ từ và lắc đều.

...

...

...

Etanol 95 %

3 phần thể tích

Axeton [(CH₃)₂CO]

1 phần thể tích

A.2. Cách tiến hành

Nhỏ dung dịch tím tinh thể lên tiêu bản và để từ 1 min đến 2 min, sau đó rửa nhanh với nước và để khô.

Nhỏ dung dịch lugol và để trong 1 min rồi rửa nhanh với nước và để khô.

Nhỏ cồn axeton rồi rửa thật nhanh với nước và để khô.

Nhỏ dung dịch fucsin loãng và để trong 1 min rồi rửa với nước và thấm khô hoặc sấy khô.

...

...

...

Xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học với vật kính dầu có độ phóng đại 100X.

Phụ lục B

(Quy định)

Phương pháp nhuộm Giemsa

B.1. Thuốc thử giemsa

Giemsa (C₁₄H₁₄CIN₃S), dạng bột 1 g

Glyxerin                                                60 ml

Metanol nguyên chất                             60 ml

...

...

...

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng thuốc thử Giemsa thương mại và pha loãng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

B.2. Cách tiến hành

Sau khi làm xong tiêu bản máu, cố định tiêu bản bằng metanol nguyên chất trong 10 min rồi rửa bằng nước. Nhỏ dung dịch Giemsa ngập tiêu bản, để trong 20 min đến 30 min rồi rửa nhanh với nước và sấy khô.

B.3. Xem tiêu bản

Xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học với vật kính dầu có độ phóng đại 100X.

Phụ lục C

(Quy định)

Phương pháp nhuộm giáp mô

...

...

...

Dung dịch A

Xanh metylen (C₁₆H₁₈N₃SCl)                    0,3 g

Etanol 95 %                                          30 ml   

Dung dịch B

Kali hydroxit                                          0,01 g

Nước                                                    100 ml.

Trộn dung dịch A và dung dịch B, lắc đều. Hỗn hợp được để trong không khí, thỉnh thoảng lắc lên trong thời gian ít nhất 1 năm trước khi sử dụng (có thể làm giảm thời gian bằng cách thêm từ từ K₂CO₃ để đạt được nồng độ cuối cùng là 1 %).

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng thuốc thử M’Fadyean thương mại.

C.2. Cách tiến hành

...

...

...

C.3. Xem tiêu bản

Xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học với vật kính dầu có độ phóng đại 100X.

Phụ lục D

(Quy định)

Phương pháp kiểm tra sự mẫn cảm của vi khuẩn B. anthracis với penicillin G

D.1. Cách tiến hành

Cấy vi khuẩn cần kiểm tra vào 1,5 ml nước thịt và nuôi cấy trong 2 h ở 37 ^oC. Điều chỉnh để đạt được độ đục 0,5 Mc Farland.

Vi khuẩn được cấy lên toàn bộ bề mặt của đĩa thạch Mueller Hinton hay thạch máu bằng một tăm bông vô trùng. Đặt đĩa giấy tẩm penicillin G 10 UI lên đĩa và ấn nhẹ để đảm bảo giấy tẩm kháng sinh tiếp xúc với môi trường. Đặt đĩa thạch ở 37 ^oC trong 18 h.

...

...

...

D.2. Đánh giá kết quả

Đánh giá vòng vô khuẩn: vòng vô khuẩn lớn hơn hoặc bằng 29 mm là mẫn cảm.

Phụ lục E

(Quy định)

Phương pháp PCR giám định độc lực của vi khuẩn B. anthracis

E.1. Chiết tách DNA

Hòa tan một vòng que cấy vi khuẩn vào 25 μl nước khử ion hay nước vô trùng. Đun nóng tới 95 ^oC trong thời gian 20 min. Sau đó, làm lạnh tới 4 ^oC và ly tâm, lấy phần dung dịch nổi để sử dụng cho phản ứng PCR.

E.2. Thành phần của phản ứng PCR

...

...

...

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng sản phẩm thương mại và làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm thương mại có chứa tất cả thành phần nguyên liệu trừ các cặp mồi và mẫu.

E.3. Các cặp mồi cho phản ứng PCR

Bảng E.3 – Các cặp mồi cho phản ứng PCR

Đích

Tên mồi

Trình tự từ đầu 5’ tới 3’

Kích thước sản phẩm

Nồng độ

Kháng nguyên bảo hộ (PA)

...

...

...

3048-3029

TCC-TAA-CAC-TAA-CGA-AGT-CG

596 bp

1 μM

PA 5

2452-2471

GAG-GTA-GAA-GGA-TAT-ACG-GT

Giáp mô

1234

...

...

...

CTG-AGC-CAT-TAA-TCG-ATA-TG

846 bp

0,2 μM

1301

2257-2238

TCC-CAC-TTA-CGT-AAT-CTG-AG

E.4. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

- Chạy 1 vòng ở 95 ^oC trong 5 min.

- Chạy 30 vòng: 95 ^oC trong 0,5 min; 55 ^oC trong 0,5 min; 72 ^oC trong 0,5 min.

...

...

...

- Làm mát ở 4 ^oC.

E.5. Chạy điện di

- Mỗi ống sản phẩm được thêm vào 10 % thể tích dung dịch thuốc nhuộm (6X).

- Cho 10 μl sản phẩm vào các giếng trên bản thạch agaroza 1 % được pha trong dung dịch TBA.

- Cho 10 μl ladder 1 kb (1 kilobase) vào giếng ngoài cùng.

- Bản thạch được điện di ở 80 V trong 1 h, sau đó được nhuộm trong dung dịch ethidi bromua.

- Khi tiến hành phản ứng PCR cần phải có đối chứng dương và đối chứng âm. Đối chứng dương là một chủng tự nhiên đã biết độc lực chứa gen PA và có giáp mô hay có thể dùng chủng Sterne (có PA) và chủng Pasteur (có giáp mô). Đối chứng âm là Bacillus spp không có độc lực, B. subtilis/ B.cereus.

E.6. Đánh giá kết quả

Xem sản phẩm điện di trên bản thạch ở máy phát tia UV.

...

...

...

Kết quả dương tính khi đối chứng âm không có vạch sản phẩm có kích thước 596 bp.

Kết quả âm tính khi đối chứng dương, đối chứng âm và mẫu kiểm tra không có vạch sản phẩm có kích thước 596 bp.

- Với giáp mô:

Kết quả dương tính khi đối chứng dương và mẫu kiểm tra có vạch sản phẩm có kích thước 846 bp và đối chứng âm không có vạch sản phẩm có kích thước 596 bp.

Kết quả âm tính khi đối chứng dương, đối chứng âm và mẫu kiểm tra không có vạch sản phẩm có kích thước 846 bp.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 5154:2009, Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp phát hiện Bacillus anthracis.

[2] MA Hornitzky, 2004, Australia and New Zealand Standard Diagnostic Procedure.

...

...

...

[4] P.J. Quin, M.E. Cater, B. Markey, G.R.Cater, 1994. Clinical veterinary microbiology.

[5] Nguyễn Vĩnh Phước, 1978. Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc.

[6] Viện Thú y quốc gia – JICA, 2002. Cẩm nang chẩn đoán tiêu chuẩn về các bệnh gia súc ở Việt Nam.

[7] World Health Organization Regional Office for South-East Asia New Delhi. Manual for Laboratory Diagnosis for Anthrax. http://www.searo.who.int/EN/Section10.