6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1. Phương pháp parafin phát hiện bệnh Lympho leuko

6.1.1. Lấy mẫu

Chọn từ 3 con gà đến 5 con gà có triệu chứng điển hình mổ lấy các bệnh phẩm sau:

- Dây thần kinh: lấy hai dây thần kinh đùi và hai đây thần kinh cánh, độ dài khoảng 2 cm;

- Gan: lấy phần gan nghi có bệnh tích với độ dày khoảng 0,5 cm;

- Lách, thận: cắt một miếng với độ dày khoảng 0,5 cm;

- Túi Fabricius: cắt ngang túi Fabricius;

- Não: mở hộp sọ, lấy phần đại não và tiểu não;

...

...

...

Các mẫu bệnh phẩm trên cho vào lọ chứa formalin (3.1.1) sao cho thể tích mẫu bệnh phẩm và formalin có tỷ lệ khoảng 1:10, ghi ký hiệu mẫu trên lọ.

CHÚ THÍCH: Đồng thời kèm theo Phiếu gửi bệnh phẩm ghi rõ yêu cầu xét nghiệm và những thông tin về dịch tễ, các biểu hiện triệu chứng, bệnh tích của bệnh.

6.1.2. Bảo quản mẫu

Mẫu bệnh phẩm (6.1.1) được đảm bảo ngập trong formalin (3.1.1), tránh đổ vỡ, rơi vãi formalin (3.1.1) ra ngoài môi trường; khi gửi mẫu đến phòng thí nghiệm, bao gói lọ chứa mẫu bằng túi nilon, miệng túi được dán kín. Trong phòng thí nghiệm, nếu chưa xét nghiệm ngay, mẫu phải được bổ sung hoặc thay mới formalin (3.1.1), đảm bảo thể tích mẫu bệnh phẩm và formalin đạt tỷ lệ khoảng 1:10.

6.1.3. Chuẩn bị mẫu

- Mẫu bệnh phẩm được cố định trong dung dịch formalin (3.1.1) trong 24 h;

- Cắt các bệnh phẩm đã cố định trên thành miếng nhỏ dày khoảng 1 mm, dài khoảng 1 cm rồi đặt vào khuôn nhựa (4.1.1).

6.1.4. Cách tiến hành

6.1.4.1. Đúc khuôn

...

...

...

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2) thời gian từ 2 đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.1.3) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.1.3) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.1.6) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

- Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.1.6) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

CHÚ THÍCH: Nếu sử dụng máy xử lý mẫu mô tự động (4.1.2) thì tiến hành tiếp theo từ bước ngâm etanol.

...

...

...

6.1.4.2. Cắt tiêu bản

- Cắt gọt khối paraffin (6.1.4.1) cho bằng phẳng, đặt trên mặt máy làm lạnh tiêu bản (4.1.5);

- Đặt khối parafin lên máy cắt tiêu bản (4.1.6) sao cho mặt khối parafin song song với mép lưỡi dao, cắt bỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đủ các bệnh phẩm, điều chỉnh độ dày của lát cắt từ 3 mm đến 5 mm, cắt một vài lát;

- Chọn lát cắt phẳng thả vào nồi dãn tiêu bản (4.1.7) với nhiệt độ nước từ 35 ^oC đến 40 ^oC. Dùng phiến kính (4.1.8) vớt lát cắt. Dựng nghiêng tiêu bản và để khô.

6.1.4.3. Nhuộm tiêu bản

- Ngâm tiêu bản (6.1.4.2) vào cốc xylen (3.1.3) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 3 min đến 5 min;

...

...

...

- Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm haematoxylin (3.1.4), thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm eosin (3.1.5), thời gian từ 60 s đến 90 s;

- Rửa dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

- Loại bỏ nước còn bám trên tiêu bản bằng cách ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2) trong thời gian từ 3 s đến 5 s, sau đó ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 s đến 5 s; chuyển tiêu bản ngâm trong cốc xylen (3.1.3) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 2 min đến 3 min; gắn lamen (4.1.9) vào tiêu bản bằng keo dán lamen (3.1.7). Để khô, soi tiêu bản dưới kính hiển vi quang học (4.1.11).

6.1.5. Đọc kết quả^[1]

U lympho thường có ở các cơ quan nội tạng như gan, lách, thận, túi Fabricius:

- Các u lympho ở gan: gồm các nguyên bào lympho tràn lan hoặc thành đám tập trung trong nhu mô gan; các tế bào này có kích thước và màu sắc đồng nhất, nhân to bắt màu haematoxylin đậm;

- Các u lympho ở lách: rải rác tăng sinh các tế bào lympho màu sắc và kích thước đồng nhất;

...

...

...

- Dây thần kinh, não, da, nang lông: không có các tế bào viêm xâm nhập.

6.1.6. Chẩn đoán phân biệt về bệnh tích vi thể

Chẩn đoán phân biệt về bệnh tích vi thể giữa bệnh Lympho leuko và bệnh Marek theo Bảng 2.

Bảng 2 - So sánh bệnh tích vi thể

Đặc điểm

Bệnh Lympho leuko

Bệnh Marek

Bệnh tích ở dây thần kinh ngoại biên

Không có

...

...

...

U cục ở gan

Các tế bào tăng sinh rải rác hoặc tràn lan

Các tế bào tăng sinh thường ở ngoại vi mạch quản

U cục ở lách

Các tế bào tăng sinh rải rác

Các tế bào tăng sinh tràn lan

Túi Fabricius

Các tế bào tăng sinh rải rác trong các nang

Các tế bào tăng sinh ở giữa các nang và/hoặc nang bị teo giảm

...

...

...

Không có

Thường xuyên

Bệnh tích ở hệ thần kinh trung ương

Không có

Có thể có

Tế bào ở các u cục

Các nguyên bào lympho đồng đều về kích thước, màu sắc

Các tế bào lympho không đồng nhất gồm: các nguyên bào lympho, tế bào lympho lớn, trung bình, nhỏ và tế bào lưới

6.2. Phương pháp realtime RT-PCR phát hiện virus gây bệnh Lympho leuko

...

...

...

Chọn từ 3 con gà đến 5 con gà có triệu chứng điển hình mổ lấy gan, lách, túi Fabricius (khối lượng tổng các loại từ 3 g đến 5 g) cho vào túi hoặc lọ đựng mẫu vô trùng, ghi ký hiệu mẫu trên túi.

6.2.2. Bảo quản mẫu

Mẫu bệnh phẩm (6.2.1) đựng trong túi hoặc lọ và bảo quản trong thùng lạnh (có nhiệt độ từ 2 ^oC đến 8 ^oC) và gửi đến phòng thí nghiệm không quá 48 h. Trong phòng thí nghiệm, nếu chưa tiến hành xét nghiệm ngay, mẫu phải được bảo quản trong tủ lạnh âm 20 ^oC (4.2.3).

CHÚ THÍCH: Đồng thời kèm theo Phiếu gửi bệnh phẩm ghi rõ yêu cầu xét nghiệm và những thông tin về dịch tễ, các biểu hiện triệu chứng, bệnh tích của bệnh.

6.2.3. Chuẩn bị mẫu

Lấy 1 g mẫu bệnh phẩm gồm gan, lách, túi Fabricicus (6.2.1 ) cắt nhỏ rồi nghiền với dung dịch PBS theo tỉ lệ 1 : 10 thành huyễn dịch trong cối chày sứ (4.2.6). Ly tâm (4.2.4) huyễn dịch ở gia tốc 3 000 g trong thời gian 5 min rồi hút lấy dịch nổi để tách chiết ARN để thực hiện phản ứng realtime RT- PCR.

6.2.4. Cách tiến hành

6.2.4.1. Tách chiết ARN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.4) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

...

...

...

6.2.4.2. Chuẩn bị mồi

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.2.1) theo phương pháp realtime RT- PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của virus gây bệnh Lympho leuko sử dụng cặp mồi và mẫu dò (primers và probe) (3.2.6) được nêu trong Bảng 3.

Bảng 3 - Cặp mồi, mẫu dò^[4]

Mẫu dò, mồi

Trình tự từ 5’ đến 3’

Mẫu dò

FAM -CCTGGGAAGGTGAGCAAGAAG- BHQ1

Mồi xuôi

TTGCAGGCATTTCTGACTGG

...

...

...

ACACGTTTCCTGGTTGTTGC

Mồi và mẫu dò được chuẩn bị như sau:

- Chuẩn bị mồi gốc và mẫu dò gốc: mồi và mẫu dò ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.2.2) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.7) để hoàn nguyên mồi và mẫu dò ở nồng độ 100 mM làm mồi gốc và mẫu dò gốc;

- Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 mM: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.8) (20 ml mồi gốc và 80 ml nước (3.2.8));

- Chuẩn bị mẫu dò sử dụng ở nồng độ 6 pM: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.8) (6 ml mồi gốc và 94 ml nước (3.2.8)).

6.2.4.3. Tiến hành phản ứng realtime PCR

Sử dụng cặp mồi và mẫu dò đã được chuẩn bị (6.2.4.2).

Sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Dùng kít nhân gen của Invitrogen SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR system (Cat # 11732 - 020) 2). Thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng 4.

...

...

...

Thành phần

Thể tích,

ml

Reaction Mix 2X

12,5

Hỗn hợp Enzym (Enzyme mix)

0,5

Mồi/mẫu dò

1,5

...

...

...

5,5

Tổng thể tích

20,0

Chuyển 20 ml hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu kiểm chứng dương: cho 5 ml mẫu ARN có giá trị Ct đã biết trước vào ống phản ứng.

- Mẫu kiểm chứng âm: cho 5 ml nước (3.2.8) vào ống phản ứng.

- Mẫu bệnh phẩm: cho 5 ml mẫu ARN (phụ lục B) vào ống phản ứng.

CHÚ Ý:

- Phản ứng realtime RT- PCR phải bao gồm: mẫu bệnh phẩm, mẫu kiểm chứng dương, mẫu kiểm chứng âm.

...

...

...

Tiến hành phản ứng bằng máy realtime PCR (4.2.1) đã được cài đặt chu trình nhiệt nêu trong bảng 5.

Bảng 5 - Chu trình nhiệt phản ứng

Nhiệt độ

Thời gian

Số chu kỳ

50 ^oC

15 min

1

95 ^oC

...

...

...

1

95 ^oC

10 s

40

60 ^oC

40s

40

6.2.5. Đọc kết quả

Đọc kết quả bằng máy reatime PCR (4.2.1) dựa trên giá trị Ct (Ct là thời điểm máy đọc realtime PCR ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền)

...

...

...

Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị Ct £ 35 được coi là dương tính; mẫu không có Ct được coi là âm tính; mẫu có giá trị 35 < Ct £ 40 được coi là nghi ngờ;

Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại theo quy trình hoặc bằng phương pháp khác để khẳng định.

7. Kết luận

Gà được xác định mắc bệnh Lympho leuko khi có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể đặc trưng của bệnh và dương tính với một trong hai phương pháp xét nghiệm quy định trong tiêu chuẩn này.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

CHUẨN BỊ DUNG DỊCH MUỐI ĐỆM PHOSPHAT (PBS)

A.1. Thành phần

...

...

...

9,47 gm

Kali dihydrophosphat (KH₂PO₄)

9,08 gm

Nước cất

900 ml

A.2. Chuẩn bị

Hòa tan natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 900 ml nước cất. Chỉnh pH đến 7,0 bằng axit clohydric.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng PBS thương mại và pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

...

...

...

(Tham khảo)

QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ARN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ARN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Qui trình tách chiết ARN sử dụng kít QIAGEN RNeasy miniKit (CAT. No. 74104) như sau:

- Lấy 600 ml dung dịch RLT (lysis buffer) cho vào ống 1,5 ml;

- Lấy 200 ml mẫu (dịch nổi) (6.2.3) vào ống có chứa dung dịch RLT. Lắc ống bằng máy lắc (4.2.5) trong 15 s;

- Cho 400 ml etanol tuyệt đối. Lắc ống bằng máy lắc trong 15 s;

- Chuyển 600 ml dung dịch sang cột lọc (dùng cho tách chiết ARN) đựng trong ống thu; ly tâm (4.2.4) với gia tốc 6 000 g trong 15 s;

- Đổ bỏ nước trong ống thu, đặt lại cột lọc vào ống thu và lặp lại bước trên với 600 ml dung dịch còn lại;

...

...

...

- Lấy 500 ml RPE nhỏ vào cột lọc, ly tâm với gia tốc 6 000 g trong 15 s: Đổ bỏ nước trong ống thu, đặt lại cột lọc vào ống. Lặp lại bước này 1 lần nữa;

- Chuyển cột lọc sang ống thu mới. Ly tâm cột lọc với gia tốc 12 000 g trong 2 min;

- Chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml Free-RNase;

- Nhỏ 50 ml nước sạch Rnase vào cột lọc, ủ trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Ly tâm với gia tốc 10 000 g trong 2 min;

- Bỏ cột lọc, giữ lại ống 1,5 ml có chứa ARN;

- Giữ mẫu ARN ở 4 ^oC trong ngày nếu chạy phản ứng realtime RT-PCR ngay và giữ ở âm 20 ^oC để lưu mẫu trong thời gian dài.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

...

...

...

[2] Laurence N. Payne, 2008, Poultry disease, 6^th Edition. Saunders Elsevier, p.276 - p.293.

[3] Nguyễn Vĩnh Phước, 1978, Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc

[4] Liting Qin, Yulong Gao, Wei Ni, Meiyu Sun, Yongqiang Wang, Chunhong Yin, Xiaole Qi, Honglei Gao, and Xiaomei Wang (2013), “Development and Application of Real-Time PCR for Detection of Subgroup J Avian Leukosis Virus”, J. Clin Microbiol. 2013 Jan; 51(1): 149-154

[5] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh, Đỗ Ngọc Thuý, 2012. Giáo trình bệnh truyền nhiễm thú y. NXB Đại học Nông nghiệp.

[6] L.N. Payne & K. Venugopal, “Neoplastic diseases: Marek’s disease, avian leukosis and reticuloendotheliosis”, Rev. sci. tech. Off. int. cpiz., 2000,19 (2), 544-564 Available at: http://wvw.oie.int/doc/ged/D9316.PDF

[7] Wang et al., “Avian leukosis virus subgroup J associated with the outbreak of erythroblastosis in chickens in China”. Virology Journal, 2013 10:92. Available at: http://www.virologyj.com/content/pdf/1743-422X-10-92.pdf.

[8] Lymphoid Leukosis in Poultry. Available at: http://www.merckmanuals.com/vet/poultry/neoplasms/lymphoid_leukosis_in_poultry.html

[9] Lymphoid Leukosis. Available at: http://www.thepoultrysite.com/publications/6/diseases-of-poultry/202/lymphoid-leukosis

1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

...

...

...