Xác định đặc tính sinh hóa theo quy định tại Phụ lục C.

6.5.3. Thử độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida

Động vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng hoặc thỏ (3.4).

Huyễn dịch tiêm: lấy khuẩn lạc phân lập được từ bệnh phẩm (sau khi đã được kiểm tra hình thái, tính chất mọc trên các môi trường và đặc tính sinh hóa) cấy vào môi trường nước thịt (3.1), nuôi cấy tĩnh (không lắc) ở tủ ấm (4.1). Sau 24 h nuôi cấy, lấy 0,2 ml canh trùng tiêm vào dưới da, xoang phúc mạc hoặc tĩnh mạch cho hai con chuột nhắt trắng (3.4) hoặc lấy 2 ml tiêm cho hai con thỏ (3.4) và theo dõi trong thời gian 7 ngày.

Đọc kết quả:

- Nếu 2 con chết: vi khuẩn Pasteurella multocida có độc lực cao;

- Nếu 1 con chết, 1 con không chết: vi khuẩn Pasteurella multocida có độc lực yếu;

- Nếu không có con nào chết: vi khuẩn Pasteurella multocida không có độc lực.

CHÚ THÍCH: Vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được từ động vật thí nghiệm chết sau khi tiêm bệnh phẩm không cần kiểm tra lại độc lực trên động vật thí nghiệm.

...

...

...

Gia cầm được xác định mắc bệnh tụ huyết trùng khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể của bệnh và phân lập được vi khuẩn Pasteurella multocida có độc lực trong phòng thí nghiệm.

Phụ lục A

(Quy định)

Phương pháp nhuộm Gram

A.1. Thuốc thử

A.1.1. Dung dịch tím tinh thể

Tím tinh thể (C₂₅H₃₀N₃Cl)

2,0 g

...

...

...

Etanol 95 % (thể tích)

20,0 ml

Amoni oxalat [(NH₄)₂C₂O₄.2H₂O]

0,8 g

Nước cất

80,0 ml

...

...

...

A.1.2. Dung dịch fuchsin đậm đặc

Fuchsin basic (C₂₀H₂₀CIN₃)

1 g

Etanol 95 % (thể tích)

10 ml

Phenol (C₆H₆O)

5 g

...

...

...

Nước cất

100 ml

Khi dùng, pha loãng dung dịch fuchsin đậm đặc với nước theo tỉ lệ 1 : 10 (thể tích).

A.1.3. Dung dịch lugol

Kali iodua (KI)

2 g

Iốt (I₂) tinh thể

...

...

...

Nước cất

200 ml

Nghiền kali iodua và iốt tinh thể, cho nước vào từ từ và lắc cho tan.

A.1.4. Cồn axeton

Etanol 95 % (thể tích)

3 phần

...

...

...

1 phần

A.2. Cách tiến hành

Nhỏ dung dịch tím tinh thể lên tiêu bản, để từ 1 min đến 2 min sau đó rửa nước nhanh và để khô.

Nhỏ dung dịch lugol, để 1 min sau đó rửa nước nhanh và để khô.

Nhỏ cồn axeton, rửa nước thật nhanh và để khô.

Nhỏ dung dịch fuchsin loãng, để 1 min sau đó rửa nước rồi thấm khô hoặc để khô.

A.3. Xem tiêu bản

Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học (4.2).

...

...

...

Phụ lục B

(Quy định)

Phương pháp nhuộm Giemsa

B.1. Thuốc thử

B.1.1. Dung dịch muối đệm phosphat (PBS), 0,01 M, pH 7,0

Thành phần

Natri hydrophosphat (Na₂HPO₄)

9,47 g

...

...

...

9,08 g

Nước cất

900 ml

Chuẩn bị

Hòa tan natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 900 ml nước cất. Chỉnh pH đến 7,0 bằng axit clohydric.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

B.1.2. Dung dịch Giemsa, 10 %

...

...

...

1 phần

Dung dịch PBS 0,01 M, pH 7,0 (A.1)

9 phần

CHÚ THÍCH: Nồng độ dung dịch Giemsa có thể thay đổi theo các phòng thí nghiệm.

B.2. Cách tiến hành

Tiêu bản máu, tiêu bản bệnh phẩm phủ tạng, tiêu bản bệnh phẩm tủy xương (xem 6.2.1) được cố định bằng metanol nguyên chất trong 10 min, rồi rửa bằng nước.

Nhỏ dung dịch Giemsa ngập tiêu bản, để từ 20 min đến 30 min, rồi rửa nhanh bằng nước và sấy khô.

...

...

...

Nhỏ 1 giọt dầu lên tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học (4.2).

Phụ lục C

(Quy định)

Các phản ứng sinh hóa của Pasteurella multocida

C.1. Môi trường và thuốc thử

C.1.1. Môi trường nước pepton

Chuẩn bị môi trường nước pepton theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

C.1.2. Thuốc thử Kovac’s

...

...

...

Paradimetyl aminobenzaldehyt

5 g

Cồn amyl (2-Metylbutan-2-ol)

75 ml

Axit clohydric đặc

25 ml

...

...

...

Trộn dung dịch paradimetyl aminobenzaldehyt vào cồn amyl cho tan hết và để trong tủ lạnh 4 °C. Thêm từ từ 5 ml đến 10 ml axit clohydric đặc, trộn đều rồi để tủ lạnh, sau đó tiếp tục bổ sung axit clohydric.

Bảo quản thuốc thử trong lọ tối màu, ở 4 °C.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng thuốc thử Kovac's thương mại và làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

C.1.3. Thuốc thử H₂O₂, 3 % (thể tích)

C.1.4. Thuốc thử Tetrammethyl-P. phenylene diamin hydrochloride, 1 % (thể tích).

C.1.5. Môi trường nước pepton - đường

C.1.5.1. Thành phần

- Nước pepton.

- Dung dịch chỉ thị màu bromocrezol: cho 0,2 g bromocrezol vào 100 ml etanol 90 % (thể tích) và lắc cho tan hết.

...

...

...

Pha glucose (hoặc sucrose, lactose, mannitol) thành dung dịch 10 % (thể tích) trong nước, hấp tiệt trùng môi trường bằng nồi hấp (4.3) ở 110 °C trong 15 min đến 20 min hoặc hấp cách quãng 3 lần ở 100 °C trong 30 min hoặc lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm.

C.1.5.2. Chuẩn bị

Cho 1 ml chỉ thị màu bromocrezol vào 100 ml môi trường nước pepton, chia ra các ống (4 ml mỗi ống). Hấp tiệt trùng bằng nồi hấp (4.3) ở 120 °C trong 30 min. Chỉnh pH môi trường ở 6,8 ± 0,2.

Thêm 0,4 ml dung dịch glucose 10 % (thể tích) hoặc sucrose 10 % (thể tích) hoặc lactose 10 % (thể tích) hoặc mannitol 10 % (thể tích) vào ống chứa 4 ml môi trường pepton đã có chất chỉ thị.

C.1.6. Môi trường thạch urê

Có thể sử dụng môi trường urê cơ bản (urea agar base - Christensen). Pha chế môi trường và bổ sung urê theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

C.1.7. Môi trường thạch lỏng kiểm tra khả năng di động

C.1.7.1. Thành phần

Pepton

...

...

...

Chất chiết thịt

3g

Natri clorua (NaCl)

5g

Thạch

4g

...

...

...

Gelatin

80 g

Nước cất

1000 ml

C.1.7.2. Chuẩn bị

Hòa gelatin vào nước để 30 min, bổ sung các thành phần khác, đun cho tan hoàn toàn.

Chia ra các ống nghiệm (4.7), khoảng 6 ml cho mỗi ống nghiệm.

...

...

...

C.1.8. Môi trường ornithine decacbolxylase

C.1.8.1. Thành phần

Pepton

0,5 g

Chất chiết nấm men

0,3 g

Glucose

...

...

...

Chỉ thị màu bromocresol purple 0,2 %

0,1 ml

L-ornithine hydrochloride

0,5 g

Nước cất

100 ml

...

...

...

C.1.8.2. Chuẩn bị

Hòa tan pepton, chất chiết nấm men, glucose trong nước, chỉnh môi trường về pH = 6,7 ± 0,2 và thêm chất chỉ thị màu bromocresol purple 0,2 %. Hấp môi trường trong nồi hấp (4.3) ở 115 °C trong 20 min.

Bổ sung thêm L-ornithine hydrochloride 0,5 %.

Chỉnh lại pH môi trường về 6,7 ± 0,2. Chia môi trường ra các ống nghiệm (4.7), mỗi ống nghiệm khoảng 2 ml.

Hấp tiệt trùng trong nồi hấp (4.3) ở 115 °C trong 10 min.

C.2. Cách tiến hành

C.2.1. Phản ứng sinh indol

Dùng que cấy (4.5) lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường nước pepton (C.1.1). Nuôi trong tủ ấm (4.1). Sau 24 h nuôi cấy, nhỏ từ 0,2 ml đến 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovac’s (C.1.2) vào môi trường, lắc nhẹ.

Đọc kết quả:

...

...

...

- Phản ứng âm tính (không sinh indol): không xuất hiện vòng màu đỏ.

C.2.2. Phản ứng catalase

Nhỏ một giọt dung dịch H₂O₂ 3 % (thể tích) (C.1.3) lên phiến kính (4.4). Dùng que cấy (4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cho vào giọt dung dịch H₂O₂ 3 % (thể tích).

Đọc kết quả sau 5 s:

- Phản ứng dương tính: có hiện tượng sủi bọt;

- Phản ứng âm tính: không có hiện tượng sủi bọt.

C.2.3. Phản ứng oxidase

Tiến hành trên giấy có tẩm dung dịch 1% Tetrammethyl-P. phenylene diamin hydrochloride.

Dùng que cấy lấy khuẩn lạc nghi ngờ phết lên mặt giấy đã thấm thuốc thử.

...

...

...

- Dương tính: tại chỗ phết khuẩn lạc có xuất hiện màu tím;

- Âm tính: không xuất hiện màu tím.

C.2.4. Kiểm tra đặc tính lên men đường

Dùng que cấy (4.5) lấy khuẩn lạc cấy vào ống môi trường nước pepton có đường glucose (hoặc sucrose, lactose, mannitol) (xem C.1.5). Nuôi trong tủ ấm (4.1), đọc kết quả sau 24 h.

- Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu vàng;

- Phản ứng âm tính: môi trường không thay đổi màu.

C.2.5. Kiểm tra khả năng phân giải urê

Dùng que cấy (4.5) lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường thạch urê (C.1.6). Nuôi trong tủ ấm (4.1), đọc kết quả sau 24 h.

- Phản ứng dương tính: môi trường chuyển sang màu hồng;

...

...

...

C.2.6. Kiểm tra khả năng di động của vi khuẩn bằng môi trường thạch lỏng

Dùng que cấy chích sâu (4.6) lấy khuẩn lạc cấy thẳng xuống gần đáy của ống nghiệm có môi trường thạch lỏng (C.1.7). Nuôi trong tủ ấm (4.1), đọc kết quả sau 24 h.

- Phản ứng dương tính (có khả năng di động): môi trường đục, không nhìn rõ đường cấy chích sâu;

- Phản ứng âm tính: môi trường trong và nhìn thấy đường cấy chích sâu.

C.2.7. Kiểm tra khả năng phân hủy ornithine

Dùng que cấy (4.5) lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường có chứa ornithine decarboxylase (C.1.8). Nuôi trong tủ ấm (4.1), sau 24 h đọc kết quả.

- Dương tính: môi trường chuyển màu tím;

- Âm tính: môi trường có màu vàng (không chuyển màu).

...

...

...

[1] JICA, 2003. Standard Diagnostic Manual for livestock diseases in Thailand. Third edition. p.110 - 111.

[2] John R. Glisson, Charles L.Hofacre, Jens P. Christense, 2008. Diseases of poultry, Chapter 19: Pasteurollosis and other Respiratory Bacterial Infection. 12th Edition, Blackwell Publishing, p. 739-758.

[3] Quinn J, Carter M.E, Markey B, Carter G.R, 2004. Veterinary Clinical Microbiology. 6th Edition. Printed in Spain, p.254 - 260.

[4] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh, Đỗ Ngọc Thúy, 2011. Giáo trình bệnh truyền nhiễm thú y.