Chuẩn bị mồi như sau:

- Chuẩn bị mồi gốc: mồi gốc và mẫu dò gốc ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.1.7) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên dùng dung dịch đệm TE (3.2.4) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 mM làm mồi gốc và mẫu dò gốc.

- Chuẩn bị mồi sử dụng: mồi sử dụng ở nồng độ 20 mM (20 ml mồi gốc được pha với 80 ml nước (3.2.5)). Mẫu dò được sử dụng ở nồng độ 6 mM (6 ml mẫu dò gốc được pha với 94 ml nước (3.2.5)). Trộn cùng 1 thể tích mồi xuôi, mồi ngược và mẫu dò sau khi pha thành hỗn hợp để tiện khi sử dụng.

6.1.4.3. Tiến hành phản ứng PCR

Sử dụng cặp mồi đã chuẩn bị (6.1.4.2). Đối với kít Invitrogen (Cat. 11730-017) (3.2.2) thành phần của một phản ứng được trình bày ở Bảng 2. Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml, có đầy đủ đối chứng âm và đối chứng dương.

Bảng 2 - Thành phần phản ứng realtime PCR

Thành phần

Thể tích

Nước tinh khiết không có nuclease

...

...

...

Platinum SuperMix UDG

12,5

Mồi xuôi

0,5

Mồi ngược

0,5

Probe

0,5

Tổng thể tích

...

...

...

Thành phần cho một phản ứng realtime PCR (theo hướng dẫn của kít thương mại được sử dụng).

Đối chứng dương: Là mẫu ADN được tách chiết từ mẫu PCV 2 chuẩn.

Đối chứng âm: sử dụng nước tinh khiết không có nuclease (3,2,5).

Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp nguyên liệu:

- Cho 20 ml hỗn hợp nguyên liệu vào ống PCR 0,2 ml.

- Cho 5 ml mẫu ARN vào ống PCR.

- Đặt ống PCR vào máy realtime PCR (4.1.4).

LƯU Ý: Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu nghi ngờ, mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm.

- Chu trình nhiệt chạy phản ứng được cài đặt theo hướng dẫn của nhà sản xuất kit sử dụng cho phản ứng. Đối với kit Invitrogen Platinum qPCR SuperMix-UDG (Cat.11730-017) (3.2.2), chu kỳ nhiệt được nêu trong Bảng 3.

...

...

...

Nhiệt độ

Thời gian

Số chu kỳ

50 °C

2 min

1 vòng

95 °C

2 min

95 °C

...

...

...

40 vòng

60 °C

40 s

CHÚ THÍCH: Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

6.1.4.4. Đọc kết quả

Phản ứng được công nhận: mẫu đối chứng dương tính (được chuẩn độ trước) phải có giá trị C_t £ 35 (± 2 C_t), mẫu đối chứng âm không có C_t.

Với điều kiện phản ứng trên:

1) Mẫu có giá trị C_t £  35 được coi là dương tính,

2) Mẫu không có giá trị C_t là âm tính.

...

...

...

Những mẫu nghi ngờ này cần được xét nghiệm lại lần 2 để khẳng định và kết luận cuối cùng.

6.2. Phương pháp ELISA

6.2.1. Lấy mẫu

Sủ dụng xylanh 5 ml và kim tiêm 22 G vô trùng, lấy từ 1,5 ml đến 2 ml máu ở vịnh tĩnh mạch cổ lợn nghi mắc bệnh PCV 2. Sau khi lấy, rút pittong lùi ra để tạo khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống nghiệm vô trùng), ghi ký hiệu mẫu trên xylanh hoặc ống nghiệm rồi đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ bình thường, tránh ánh nắng trực tiếp.

6.2.2. Bảo quản mẫu

Mẫu được bảo quản theo mục 6.1.2.

6.2.3. Chuẩn bị mẫu

Tất cả các mẫu máu được chắt huyết thanh từ xylanh (6.2.1) sang ống nghiệm vô trùng. Thời gian kể từ lúc lấy máu đến lúc chắt huyết thanh không quá 24 h, ghi ký hiệu của mẫu lên ống chứa huyết thanh.

6.2.4. Cách tiến hành

...

...

...

CHÚ THÍCH: Phương pháp này nhanh và dễ thực hiện. Tuy nhiên, không phân biệt được kháng thể do tiêm phòng vắc xin PCV 2 hay kháng thể do nhiễm thực địa.

Ví dụ: sử dụng phương pháp ELISA phát hiện kháng thể PCV 2 theo quy trình của kít GreenSpring® Ab Test thì bước tiến hành được thực hiện như sau:

a) Chuẩn bị

- Nguyên liệu trong bộ kít (3.4.1) để ở nhiệt độ phòng 30 min trước khi làm phản ứng.

- Pha loãng dung dịch rửa 1X: 10 ml dung dịch nước rửa đặc 10X với 90 ml nước cất khử ion (3.4.2).

- Pha loãng mẫu với tỷ lệ 1/40: 10 ml mẫu kiểm tra với 390 ml dung dịch pha loãng mẫu trong ống pha loãng. Sau đó 100 ml dung dịch mẫu kiểm tra đã pha loãng sang đĩa ELISA với bố trí mẫu tương ứng.

b) Tiến hành phản ứng ELISA

Bố trí sơ đồ đĩa ELISA phản ứng (tham khảo Phụ lục C).

1. Nhỏ 100 ml đối chứng âm chuẩn vào giếng A1 và A2;

...

...

...

3. Để trống 2 giếng C1 và C2 (Blank control well);

4. Nhỏ 100 ml huyết thanh cần kiểm tra được pha loãng vào giếng D1 và D2, E1 và E2 nhỏ lần lượt cho đến hết các mẫu cần kiểm tra (mỗi mẫu làm 2 giếng);

5. Lắc đĩa nhẹ nhàng, ủ đĩa ở 37 °C (4.2.2) trong 30 min;

6. Rửa đĩa từ 3 lần đến 5 lần với lượng 300 ml cho mỗi giếng bằng nước rửa đã pha loãng;

7. Nhỏ 100 ml chất gắn kết (conjugate) vào tất cả các giếng;

8. Đậy nắp đĩa và ủ ở 37 °C (4.2.2) trong 30 min;

9. Lặp lại bước 5;

10. Nhỏ 1 giọt (khoảng 50 ml) cơ chất A và 1 giọt (khoảng 50 ml) cơ chất B vào tất cả các giếng;

11. Lắc nhẹ đĩa, đậy nắp và ủ đĩa ở 25 °C trong 10 min để tránh ánh sáng;

...

...

...

13. Đưa vào máy đọc ELISA (4.2.1) để đo mật độ quang học (OD) ở bước sóng 650 nm.

CHÚ THÍCH: Kết quả được đọc trong khoảng 10 min sau khi nhỏ dung dịch dừng phản ứng.

6.2.5. Đọc kết quả

+ mật độ quang học (OD) của đối chứng âm £ 0,2

+ OD của đối chứng dương - OD của đối chứng âm ³ 0,2

- Đánh giá kết quả:

S/P =

(OD của mẫu - OD của đối chứng âm)

(OD của đối chứng dương - OD của đối chứng âm)

...

...

...

+ Mẫu âm tính: S/P < 0,4

Trong đó OD_TB650 là mật độ quang học trung bình đo ở bước sóng 650 nm.

CHÚ THÍCH : Đối với những mẫu nghi ngờ phải làm lại để khẳng định, nếu vẫn nghi ngờ thì dựa vào dịch tễ học để kết luận bệnh.

7. Kết luận

Lợn được cho là dương tính với hội chứng suy mòn ở lợn con sau cai sữa do virus circo type 2 khi có các đặc điểm về triệu chứng, bệnh tích điển hình và có kết quả xét nghiệm dương tính với PCV 2 hoặc dương tính kháng thể PCV 2 bằng các phương pháp trong tiêu chuẩn này.

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị dung dịch thử

...

...

...

A.1.1. Thành phần

Penicillin

Mycostatin

Streptomycin

Kanamycin

Nước cất

1 000 000 UI

250 000 UI

200 mg

...

...

...

10 ml

A.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan kháng sinh bằng nước cất rồi lọc bằng màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 mm. Bảo quản ở âm 20 °C (4.1.2).

A.2. Dung dịch muối đệm phosphat (PBS), 0,01 M, pH 7,2

A.2.1. Thành phần

Natri clorua (NaCl)

Kali clorua (KCl)

Dinatri hidrophosphat (Na₂HPO₄)

Kali dihidrophosphat (KH₂PO₄)

...

...

...

8 g

0,2 g

1,15 g

0,2 g

1 000 ml

A.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước, chỉnh pH đến 7,2 bằng dung dịch natri hydroxit (NaOH) 1 N hoặc dung dịch axit clohydric (HCl) 1 N. Hấp tiệt trùng bằng nồi hấp, chia nhỏ và bảo quản ở 4 ^oC (4.1.3).

Phụ lục B

...

...

...

Quy trình tách chiết ADN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Tách chiết ADN theo quy trình của kít Invitrogen (Cat No. 69506): thực hiện như sau:

- Nhỏ 200 ml huyễn dịch bệnh phẩm (6.1.3) vào ống 1,5 ml cùng với 200 mI Lysis buffer có 25 ml proteinase K, lắc đều trên máy lắc trộn Vortex (4.1.6) trong 15 s rồi ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.5) ở 8 000 g trong 1 min;

- Ủ hỗn hợp này ở 56 °C trong 15 min;

- Ly tâm (4.1.5) ở 8 000 g trong 1 min, thêm 250 ml etanol tuyệt đối vào ống, lắc mạnh bằng máy lắc trộn Vortex trong 15s rồi ủ 5 min;

- Ly tâm (4.1.5) ở 10 000 g trong 1 min;

- Chuyển toàn bộ hỗn hợp (675 ml) sang cột lọc có ống thu;

- Ly tâm (4.1.5) ở 8 000 g trong 1 min. Thay cột thu mới;

...

...

...

- Cho 500 ml nước rửa (washing buffer) vào cột lọc. Ly tâm bằng (4.1.5) 13 000 g trong 1 min;

- Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu trong 2 min ở tốc độ tối đa, bỏ ống thu;

- Đặt cột lọc vào ống thu ADN, nhỏ 50 ml nước không chứa men DNase vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 1 min. Tách ADN bằng cách ly tâm (4.1.5) ở 13 000 g trong 1 min, bỏ cột lọc, giữ lại dịch trong ống thu AND;

Bảo quản mẫu ADN thu được ở 4 °C (4.1.3) trong thời gian ngắn trước khi tiến hành chạy realtime PCR. Nếu thực hiện sau 24 h, nên bảo quản mẫu ở nhiệt độ không lớn hơn âm 20 °C (4.1.2).

Phụ lục C

(Tham khảo)

Sơ đồ bố trí mẫu trong đĩa ELISA xét nghiệm kháng thể PCV 2

Bảng C.1 - Sơ đồ đĩa ELISA

...

...

...

1

2

3

4

5

6

7

8

9

...

...

...

11

12

A

NC (-)

NC(-)

S6

S6

S14

S14

...

...

...

S22

S30

S30

S38

S38

B

PC (+)

PC (+)

S7

...

...

...

S15

S15

S23

S23

S31

S31

S39

S39

C

...

...

...

Blank

S8

S8

S16

S16

S24

S24

S32

S32

...

...

...

S40

D

S1

S1

S9

S9

S17

S17

S25

...

...

...

S33

S33

S41

S41

E

S2

S2

S10

S10

...

...

...

S18

S26

S26

S34

S34

S42

S42

F

S3

...

...

...

S11

S11

S19

S19

S27

S27

S35

S35

S43

...

...

...

G

S4

S4

S12

S12

S20

S20

S28

S28

...

...

...

S36

S44

S44

H

S5

S5

S13

S13

S21

...

...

...

S29

S29

S37

S37

S45

S45

CHÚ THÍCH: PC (positive control): đối chứng dương

NC (negative control): đối chứng âm

S1 đến S45 (sample): mẫu xét nghiệm

...

...

...

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Chang et al (2010), Fast diagnosis and Quantification of Porcine Circovirus type 2 (PCV-2) using Realtime polymerase Chain reaction, J Microbiol Immunol Intect 2010; 43(2):85-92

[2] C. Chae (2004) Postweaning multisystemic wasting syndrome: a review of aetiology, diagnosis and pathology, The Veterinary Jounal 168 (2004) 41-49

[3] T. Opriessnig et al (2007), Porcine Circovirus type 2 - associated disease: Update on current terminology, clinacal manifestations, pathogenesis, diagnosis, and intervention strategies, J Vet Diagn Invest 19:591-615 (2007)

1) Sản phẩm do hãng Invitrogen cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.