6  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1  Lấy mẫu

- Nếu gà còn sống: lấy mẫu là dịch ngoáy ở hốc mắt, hốc mũi, hầu họng, khí quản.

Sát trùng bên ngoài vị trí lấy mẫu bằng bông cồn (3.5), dùng tăm bông vô trùng (3.6) ngoáy vào từng vị trí lấy mẫu rồi cho vào môi trường nuôi cấy (3.1).

- Nếu gà đã chết: lấy mẫu là dịch ở hốc mắt, hốc mũi, hầu họng, khí quản, phổi, các túi khí, dịch khớp gối chân.

Bệnh phẩm là dịch ở hốc mắt, hốc mũi, hầu họng, khí quản, các túi khí, dịch ở khớp chân: sát trùng bên ngoài vị trí lấy mẫu bằng bông cồn (3.5), dùng tăm bông vô trùng (3.6) hoặc xi lanh vô trùng để hút dịch ở từng vị trí lấy mẫu rồi cho vào môi trường nuôi cấy (3.1).

Bệnh phẩm là các túi khí: dùng kéo (4.8) mở xoang ngực, xoang bụng của gà, dùng panh (4.8) gạt phủ tạng để bộc lộ rõ túi khí, dùng tăm bông vô trùng (3.6) ngoáy vào túi khí rồi cho vào môi trường nuôi cấy (3.1).

Bệnh phẩm là phổi: Lấy mẫu vô trùng từ 10 g đến 100 g, cho vào từng lọ hay túi vô trùng riêng biệt, đậy kín, ghi ký hiệu mẫu

Mẫu bệnh phẩm nên được nuôi cấy trên môi trường càng nhanh càng tốt. Trong trường hợp phải vận chuyển đến phòng thí nghiệm thì mẫu bệnh phẩm phải được đựng trong các ống mẫu đã có môi trường thích hợp cho nuôi cấy vi khuẩn M. gallisepticum (môi trường Frey, xem 3.1), đậy kín, bảo quản trong điều kiện lạnh từ 2°C đến 8°C và gửi về phòng thí nghiệm trong vòng 24 h sau khi lấy mẫu. Gửi kèm theo bệnh phẩm giấy yêu cầu xét nghiệm có ghi rõ triệu chứng, bệnh tích và đặc điểm dịch tễ.

...

...

...

6.2.1  Xử lý mẫu

- Ống chứa mẫu bệnh phẩm được lắc bằng máy lắc (4.4) trong 15 s, sau đó ly tâm với gia tốc 6000 g trong 15 s.

- Dùng pipet hút dịch trong ống chuyển sang 2 ống 1,5 ml. Một ống dùng để xét nghiệm PCR, ống còn lại dùng làm mẫu lưu, bảo quản ở nhiệt độ 4°C.

6.2.2  Cách tiến hành

Huyễn dịch bệnh phẩm sau khi xử lý (xem 5.2.2.1) được thực hiện chiết tách ADN bằng các kít thương mại theo hướng dẫn của nhà sản xuất và bảo quản mẫu ADN ở 4°C.

Sử dụng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu và chu trình nhiệt được nêu trong bảng 2 và bảng 4.

Bảng 2 - Cặp mồi xác định vi khuẩn M. gallisepticum

Gen đích

Tên mồi

...

...

...

Kích thước sản phẩm (bp)

16S rRNA

MG-14F

GAG-CTA-ATC-TGT-AAA-GTT-GGT-C

185

MG-13R

GCT-TCC-TTG-CGG-TTA-GCA-AC

- Tiến hành phản ứng PCR theo quy định tại Phụ lục B.

6.3  Phân lập và xác định vi khuẩn M. gallisepticum bằng phương pháp PCR

...

...

...

- Với mẫu là tăm bông có dịch ngoáy (ở hốc mắt, hốc mũi, hầu họng, khí quản, túi khí) đã được lấy vô trùng: cho vào môi trường nuôi cấy (3.1).

- Với mẫu là dịch khớp gối được hút bằng xi lanh vô trùng: cho vào môi trường nuôi cấy (3.1).

- Với mẫu là phổi: sát trùng bề mặt ngoài của phổi bằng bông cồn (3.5), rồi dùng kéo (4.8) cắt sâu vào tổ chức phổi bên trong lấy một mẩu nhỏ cho vào môi trường nuôi cấy (3.1).

6.3.2  Phân lập vi khuẩn

Bệnh phẩm được nuôi cấy vào môi trường nước Frey (3.1), thạch Frey (3.2), nuôi ở tủ ấm (4.1). Kiểm tra kết quả nuôi cấy hàng ngày, trong khoảng từ 7 ngày đến 10 ngày.

Môi trường nước Frey: môi trường nuôi cấy chuyển màu (từ màu đỏ sang màu cam hoặc màu vàng). Khi môi trường nuôi cấy chuyển màu, lấy canh khuẩn này cấy chuyển sang môi trường thạch Frey.

Trong trường hợp môi trường Frey đã nuôi cấy từ 7 ngày đến 10 ngày không chuyển màu, lấy canh khuẩn cấy chuyển sang môi trường thạch Frey (3.2).

Môi trường thạch Frey: khuẩn lạc của vi khuẩn M.gallisepticum nhỏ (đường kính khoảng từ 0,2 mm đến 0,3 mm), trơn, rìa gọn, tạo thành khối mờ, ở giữa hơi lồi.

Chọn khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào môi trường thạch Frey và nuôi ở tủ ấm (4.1) để xác định PCR.

...

...

...

Vi khuẩn M. gallisepticum nghi ngờ đã được nuôi cấy thuần trên môi trường thạch Frey được tách chiết ADN bằng kít thương mại hoặc bằng phương pháp sốc nhiệt (Xem B.2 phụ lục B).

Sử dụng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu và chu trình nhiệt được nêu trong bảng 2 và bảng 4.

Tiến hành phản ứng PCR theo quy định tại Phụ lục B

6.4  Chẩn đoán huyết thanh học

Chẩn đoán huyết thanh học (tham khảo Phụ lục C) ứng dụng để chẩn đoán sự nhiễm bệnh trên toàn đàn.

Các phản ứng huyết thanh học thường dùng để phát hiện kháng thể là phản ứng ngưng kết hoặc phản ứng miễn dịch gắn enzyme (phản ứng ELISA)

7  Kết luận

Gà được kết luận mắc bệnh viêm đường hô hấp mãn tính khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích của bệnh và phân lập, xác định bằng phương pháp PCR dương tính với vi khuẩn M. gallisepticum.

...

...

...

(Quy định)

Môi trường nuôi cấy cho vi khuẩn Mycoplasma gallisepticum

A.1  Môi trường nước Frey

Pha chế môi trường nước Frey gồm 2 dung dịch thành phần:

Dung dịch A:

Môi trường PPLO (không có crystal violet)                                    14,7 g

Nước                                                                                          700 ml

Hòa tan môi trường PPLO trong nước.

Vô trùng bằng nồi hấp (4.3) ở 121°C trong 15 min.

...

...

...

Huyết thanh lợn (hoặc huyết thanh ngựa)

150 ml

Cao nấm men 25 %

100 ml

Dung dịch đường glucose 10 %

10 ml

Thallous acetate

10 ml

Penicilin G 2000 UI

...

...

...

Đỏ phenol 0,1 %

20 ml

Hòa các dung dịch trên với nhau.

Điều chỉnh pH dung dịch B = 7,8 - 8,0 (bằng dung dịch NaOH 0,1 M).

Vô trùng dung dịch B bằng màng lọc (4.9).

Môi trường nước Frey:

Dung dịch A đã vô trùng và để nguội khoảng 40°C đến 50°C sẽ được bổ sung với dung dịch B vô trùng.

Chia ra các ống nghiệm vô trùng, khoảng 5 ml đến 10 ml môi trường / ống.

Bảo quản môi trường ở 4°C.

...

...

...

Pha chế môi trường thạch Frey, là môi trường nước Frey có bổ sung thạch (agar), gồm 2 dung dịch thành phần:

Dung dịch A:

Môi trường PPLO (không có crystal violet)

14,7 g

Thạch (agar)

10 g

Nước

700 ml

Hòa tan môi trường PPLO và thạch trong nước.

...

...

...

Dung dịch B:

Huyết thanh lợn (hoặc huyết thanh ngựa)

150 ml

Cao nấm men 25 %

100 ml

Thallous acetate

10 ml

Penicilin G 2000 UI

...

...

...

Đỏ phenol 0,1 %

20 ml

Hòa các dung dịch trên với nhau.

Điều chỉnh pH dung dịch B = 7,8 - 8,0 (bằng dung dịch NaOH 0,1 M).

Vô trùng dung dịch B bằng màng lọc (4.9).

Môi trường thạch Frey:

Dung dịch A đã vô trùng và để nguội khoảng 40°C đến 50°C sẽ được bổ sung với dung dịch B vô trùng.

Chia ra đĩa lồng vô trùng, khoảng 20 ml thạch / đĩa.

Bảo quản môi trường ở 4°C.

...

...

...

Phụ lục B

(Quy định)

Xác định vi khuẩn Mycoplasma gallisepticum bằng phương pháp PCR

B.1  Nguyên liệu PCR

B.1.1  Taq PCR Master Mix Kit

B.1.2  Cặp mồi (primers): mồi xuôi (MG-14F) và mồi ngược (MG-14R) (Bảng 2)

B.1.3  Nước tinh khiết không có nuclease

B.1.4  Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

B.1.5  Ethidi bromua hoặc chất nhuộm màu SYBR green

...

...

...

B.1.7 ADN (Acid Deoxyribo Nucleic) chuẩn (Ladder, marker)

B.1.8  Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic)

B.2  Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra là huyễn dịch bệnh phẩm đã được xử lý (xem 5.2.2.1); hoặc là vi khuẩn M. gallisepticum nghi ngờ đã được nuôi cấy thuần khiết trên thạch Frey (xem 5.2.3.1).

Mẫu đối chứng dương: chủng vi khuẩn đã được xác định là M. gallisepticum hoặc sử dụng các chủng Mycoplasma gallisepticum chuẩn.

Tách chiết ADN

Tách chiết ADN bằng các kít thương mại đối với mẫu kiểm tra là huyễn dịch bệnh phẩm hoặc vi khuẩn thì các bước tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Đối với vi khuẩn còn có thể tách chiết ADN bằng phương pháp sốc nhiệt.

Tách chiết bằng phương pháp sốc nhiệt: Lấy từ 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc, hòa vào 100 μI nước vô trùng không chứa nuclease (nuclease free water). Đun sôi cách thủy trong 10 min rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá 5 min. Ly tâm huyễn dịch bằng máy ly tâm (4.5) với gia tốc 12 000 g trong 4 min. Thu hoạch phần trong phía trên để thực hiện phản ứng PCR.

...

...

...

Mồi được chuẩn bị như sau:

- Chuẩn bị mồi gốc: mồi gốc ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy li tâm (4.5) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (B.1.8) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 μM làm mồi gốc;

- Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 μM: pha loãng mồi gốc bằng nước (B.1.3).

VÍ DỤ: lấy 20 μl mồi gốc có nồng độ 100 μl và thêm 80 μl nước sẽ được mồi sử dụng có nồng độ 20 μM / μl.

B.4  Tiến hành

Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (xem B.3). Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml.

Sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng kít nhân gen Taq PCR Mastermix kit Qiagen (Cat. No. 201223)1) thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng 3 và chu trình nhiệt trong bảng 4.

Bảng B.1 - Thành phần của phản ứng PCR xác định M.gallisepticum

...

...

...

Thể tích (μl)

Nước không có nuclease

35,75

PCR Bufffer

5,0

dNTP 10mM

1,0

Mồi xuôi 20 μM

0,5

...

...

...

0,5

Taq 5U/μl

0,25

MgCl₂ 50 mM

2,0

Mẫu ADN

5,0

Tổng thể tích

50,0

...

...

...

Bảng B.2 - Chu trình nhiệt xác định vi khuẩn M. gallisepticum

Nhiệt độ

Thời gian

Số chu kỳ

95°C

2 min

1 vòng

95°C

10 s

...

...

...

55°C

20 s

72°C

30 s

72°C

5 min

1 vòng

Đối chứng dương: ADN tách chiết từ vi khuẩn M. gallisepticum (xem B.2).

Đối chứng âm: gồm đầy đủ thành phần của một phản ứng PCR, nhưng không có ADN của vi khuẩn.

...

...

...

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.6) với chu trình nhiệt nêu trong bảng 4.

B.5  Chạy điện di

Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose 1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE.

Cho 2 μl dung dịch loading dye vào 8 μl sản phẩm PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch. Cho 10 μl thang chuẩn (marker) vào một giếng.

Bản thạch được chạy điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại dung dịch đệm sử dụng khi pha thạch) ở bộ điện di (4.7), trong thời gian từ 30 min đến 40 min, ở 100 V.

Sau đó nhuộm bằng dung dịch ethidi bromua 0,2 mg / 100ml.

Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (VÍ DỤ: như SYBR safe ADN gel stain của hãng Invitrogen) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.

B.6  Đọc kết quả

Phản ứng dương tính khi:

...

...

...

- Mẫu đối chứng âm: không xuất hiện vạch.

- Mẫu kiểm tra có vạch giống mẫu đối chứng dương.

Phản ứng âm tính khi:

- Mẫu đối chứng dương có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm.

- Mẫu đối chứng âm: không xuất hiện vạch.

- Mẫu kiểm tra không có vạch giống mẫu đối chứng dương.

Phụ lục C

(Tham khảo)

...

...

...

C.1  Phản ứng ngưng kết trên phiến kính

 C.1.1  Chuẩn bị

- Huyết thanh: huyết thanh kiểm tra (có thể là máu toàn huyết), huyết thanh đối chứng (âm và dương chuẩn);

- Kháng nguyên chuẩn. Phản ứng ngưng kết thường sử dụng kháng nguyên thương phẩm. Tiến hành phản ứng và đọc kết quả theo hướng dẫn của nhà sản xuất;

- Dụng cụ khác: phiến kính sạch, que khuấy, đồng hồ tính giờ, đầu típ, cốc xả tip,..

C.1.2  Tiến hành

- Nhỏ 1 giọt (khoảng 30 μl) huyết thanh (hoặc máu toàn phần) lên phiến kính;

- Nhỏ 1 giọt (khoảng 30 μl) kháng nguyên thương phẩm lên phiến kính, bên cạnh giọt huyết thanh;

- Dùng que khuấy để trộn giọt huyết thanh và giọt kháng nguyên. Khuấy thành vòng rộng khoảng 1 cm; và lắc đều khoảng 2 phút và đọc kết quả;

...

...

...

- Tiến hành xét nghiệm mẫu phải làm cùng huyết thanh âm và và huyết thanh dương chuẩn.

- Mẫu huyết thanh làm phản ứng ngưng kết nhanh nên được làm ngay sau khi lấy mẫu. Nếu chưa làm được ngay thì bảo quản ở 4°C và không được để đông đá.

C.1.3  Đọc kết quả

Đọc kết quả sau 2 phút sau lắc:

Dương tính: xuất hiện hạt ngưng kết, lấm tấm (giống đối chứng dương)

Âm tính: không xuất hiện hạt ngưng kết (giống đối chứng âm)

C.2  Phản ứng miễn dịch gắn enzyme (ELISA)

C.2.1  Chuẩn bị mẫu

- Lấy mẫu: Sử dụng xi-lanh (3.7) và kim tiêm vô trùng, lấy từ 1,5 ml đến 2 ml máu tĩnh mạch cánh hoặc máu tim của gà nghi mắc bệnh nhưng chưa tiêm phòng vắc xin. Sau khi lấy, rút pit-tong lùi ra để tạo khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống nghiệm vô trùng), ghi ký hiệu mẫu trên xi-lanh hoặc ống nghiệm rồi đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ bình thường, tránh ánh nắng trực tiếp.

...

...

...

- Chắt huyết thanh từ xi-lanh sang ống nghiệm vô trùng, kể từ lúc lấy máu đến lúc chắt huyết thanh không quá 24 h, ghi ký hiệu của mẫu lên ống chứa huyết thanh.

C.2.2  Cách tiến hành

VÍ DỤ: dùng bộ kít phát hiện kháng thể Mycoplasma gallisepticum Antibody Test Kit của hãng IDEXX2)

C.2.2.1  Chuẩn bị nguyên liệu

- Các nguyên liệu của bộ kít được bảo quản ở nhiệt độ 4°C, trước khi tiến hành phản ứng phải được đem ra để cân bằng với nhiệt độ phòng (từ 18°C đến 26°C);

- Mẫu huyết thanh (6.3.3): được pha loãng thành 1/500 với dung dịch pha loãng mẫu (Lấy 1 μl huyết thanh pha với 500 μl dung dịch pha loãng mẫu);

- Pha loãng dung dịch rửa đậm đặc 10 lần (Wash Concentrate 10 X): lấy 1 phần nước rửa đậm đặc pha với 9 phần nước cất;

- Tính thể tích dung dịch nước rửa cần pha: 300 μl/giếng x 3 lần rửa x 2 bước rửa x số giếng sử dụng;

- Sơ đồ bố trí mẫu: trong sơ đồ bố trí mẫu phải có mẫu trắng (Blank), kiểm chứng âm (Negative Control - NC), kiểm chứng dương (Positive Control - PC).

...

...

...

Bước 1: Nhỏ huyết thanh

- Nhỏ 100 μl dung dịch pha loãng mẫu vào giếng có mẫu trắng (Blank);

- Nhỏ 100 μl kiểm chứng âm không pha loãng vào hai giếng đối chứng âm;

- Nhỏ 100 μl kiểm chứng dương không pha loãng vào hai giếng đối chứng dương;

- Nhỏ 100 μl huyết thanh (6.3.4.1) đã pha loãng vào các giếng thích hợp;

- Để đĩa ở nhiệt độ trong khoảng từ 18°C đến 26°C trong 30 min;

- Đổ bỏ dung dịch trong đĩa;

- Nhỏ 350 μl dung dịch rửa vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Lặp lại từ 3 lần đến 5 lần.

Bước 2: Nhỏ kháng kháng thể (conjugate)

...

...

...

- Để đĩa ở nhiệt độ trong khoảng từ 18°C đến 26°C trong 30 min;

- Đổ bỏ dung dịch trong đĩa;

- Nhỏ 350 μl dung dịch rửa vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Lặp lại từ 3 lần đến 5 lần.

Bước 3: Nhỏ cơ chất

- Nhỏ 100 μl dung dịch cơ chất TMB vào các giếng;

- Để đĩa ở nhiệt độ trong khoảng từ 18°C đến 26°C trong 15 min.

Bước 4: Dừng phản ứng

- Nhỏ 100 μl dung dịch dừng phản ứng (Stop Solution) vào các giếng;

Đo giá trị OD (mật độ quang học) bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 650 nm.

...

...

...

Điều kiện phản ứng được công nhận khi:

- Giá trị OD của đối chứng dương trừ giá trị OD của đối chứng âm phải lớn hơn 0,075;

- Giá trị OD của đối chứng âm lớn hơn hoặc bằng 0,15.

Tính kết quả:

- Trung bình của đối chứng âm: [NC1 A (650) + NC2 A(650)] / 2 = NC x tb

- Trung bình của đối chứng dương: [PC1 A (650) + PC2 A (650)] / 2 = PC x tb

- Tỷ lệ S/P = (giá trị OD của mẫu - NC x tb) / (PC x tb - NC x tb)

- Hiệu giá của mẫu: log₁₀ Titer = 1,09 (log₁₀ S/P) + 3,36

CHÚ THÍCH: S/P là tỉ lệ được tính toán giữa giá trị OD của mẫu bệnh phẩm so với giá trị OD của mẫu kiểm chứng dương.

...

...

...

- Mẫu huyết thanh dương tính với kháng thể Gumboro có S/P lớn hơn hoặc bằng 0,20;

- Mẫu huyết thanh âm tính với kháng thể Gumboro có S/P nhỏ hơn 0,20.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] JICA, 2003. Standard Diagnostic Manual for livestock diseases in Thailand. Third edition, p.175 - 176.

[2] Stanley H. Kleven, 2008. Diseases of poultry, Chapter 21: Mycoplasmosis. 12th Edition, Blackwell Publishing, p. 805 - 821.

[3] Quinn J, Carter M.E, Markey B, Carter G.R, 2004. Veterinary Clinical Microbiology. 6th Edition. Printed in Spain, p.320 - 326.

[4] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh, Đỗ Ngọc Thúy, 2011. Giáo trình bệnh truyền nhiễm thú y, trang 425 - 430.

1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng nếu tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

...

...

...