TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8683-17:2017

GIỐNG VI SINH VẬT THÚ Y - PHẦN 17: QUY TRÌNH GIỮ GIỐNG VI KHUẨN BORDETELLA BRONCHISEPTICA

Master seed of microorganisms for veterinary use - Part 17: The procedure for preservation Bordetella bronchiseptica bacteria

Lời nói đầu

TCVN 8683-17 : 2017 do Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y TW1 - Cục  Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 8683 Giống vi sinh vật thú y - Quy trình giữ giống gồm các phần:

- TCVN 8683-1 : 2011, Phần 1: Quy trình giữ giống vi rút dịch tả lợn qua thỏ, chủng C;

...

...

...

- TCVN 8683-3 : 2011, Phần 3: Quy trình giữ giống vi rút Newcastle, chủng hệ I;

- TCVN 8683-4 : 2011, Phần 4: Quy trình giữ giống vi rút dại chủng cố định;

- TCVN 8683-5 : 2011, Phần 5: Quy trình giữ giống vi khuẩn đóng dấu lợn nhược độc, chủng VR2;

- TCVN 8683-6 : 2011, Phần 6: Quy trình giữ giống vi khuẩn nhiệt thán vô độc, chủng 34 F2;

- TCVN 8683-7 : 2011, Phần 7: Quy trình giữ giống vi khuẩn nhiệt thán cường độc, chủng 17JB;

- TCVN 8683-8 : 2011, Phần 8: Quy trình giữ giống vi khuẩn phó thương hàn lợn, các chủng SC. 1; SC.2; SC.4 và SC.5;

- TCVN 8683-9 : 2011, Phần 9: Quy trình giữ giống vi khuẩn tụ huyết trùng trâu bò, các chủng PB.1, PB.2, P.52, PBU.1 và PBU.2;

- TCVN 8683-10 : 2011, Phần 10: Quy trình giữ giống vi khuẩn tụ huyết trùng lợn nhược độc, chủng AVPS3;

- TCVN 8683-11 : 2011, Phần 11: Quy trình giữ giống vi khuẩn tụ huyết trùng lợn, chủng PS1;

...

...

...

- TCVN 8683-13 : 2011, Phần 13: Quy trình giữ giống vi khuẩn đóng dấu lợn, các chủng E.37, E.47 và E.80;

- TCVN 8683-14 : 2011, Phần 14: Quy trình giữ giống vi khuẩn ung khí thán, các chủng CL.C1 và CL.C2;

- TCVN 8683-15 : 2017, Phần 15: Quy trình giữ giống vi rút viêm gan vịt cường độc;

- TCVN 8683-16  :2017, Phần 16: Quy trình giữ giống vi rút gumboro nhược độc chủng 2512;

-TCVN 8683-17 : 2017, Phần 17: Quy trình giữ giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica.

GIỐNG VI SINH VẬT THÚ Y - PHẦN 17: QUY TRÌNH GIỮ GIỐNG VI KHUẨN BORDETELLA BRONCHISEPTICA

Master seed of microorganisms for veterinary use - Part 17: The procedure for preservation Bordetella bronchiseptica bacteria

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

...

...

...

Tiêu chuẩn này quy định quy trình giữ giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica được dùng để sản xuất và kiểm nghiệm vắc xin.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8684 : 2011, vắc xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y - Phép thử độ thuần khiết.

3  Nguyên tắc

Lấy giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica được giữ ở dạng đông khô để kiểm tra đặc tính sinh học của giống bằng các phương pháp phân tích trong phòng thí nghiệm. Sau đó giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica được tăng cường qua lợn, phân lập lại vi khuẩn từ máu tim của những lợn chết hoặc có triệu chứng lâm sàng của bệnh. Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thích hợp, chọn những khuẩn lạc điển hình để đông khô và bảo quản quản ở nhiệt độ 2 °C đến 8 °C.

4  Vật liệu và thuốc thử

4.1  Vật liệu

4.1.1  Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica, đây là giống gốc, đáp ứng các yêu cầu về độ vô trùng, tính độc, tính gây miễn dịch, được nhận dạng và xác định đặc tính nuôi cấy

...

...

...

4.1.3  Lợn trọng lượng từ 8 kg đến 10 kg, khỏe mạnh, không có kháng thể Bordetella bronchiseptica

4.1.4  Chuột nhắt trắng trọng lượng từ 18 g đến 20g, khỏe mạnh

4.2  Thuốc thử

4.2.1  Kháng huyết thanh

4.2.2  Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Blood agar base (BAB), Brain heart Infusion (BHI)

4.2.3  A xít clohydric 1N (HCI 1N)

4.2.4  Các loại muối: Natri clorua (NaCI), Kali clorua (KCI), Natri hiđro photphat (Na₂HPO₄), Mono kali photphat (KH₂PO₄)

4.2.5  Giấy quỳ kiểm tra pH

4.2.6  Formaldehyde solution min 37% (HCHO)

...

...

...

4.2.8  Methionate

4.2.9  Dung dịch PBS pH 7,2

5  Thiết bị, dụng cụ

5.1  Tủ ấm CO₂ có thể duy trì nhiệt độ 37 °C

5.2  Tủ lạnh (có thể duy trì nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C), tủ lạnh sâu (có thể duy trì nhiệt độ âm 80 °C)

6.3  Tủ âm sâu có nhiệt độ âm sâu tới âm 20 °C

5.4  Máy lắc trộn (vortex mixer) có tốc độ lắc từ 50 rpm đến 2400 rpm

5.5  Máy ly tâm, ly tâm với gia tốc 12 000 g

5.6  Nồi cách thủy có thể duy trì ở các nhiệt độ 100 °C, 110 °C, 121 °C trong thời gian 10 min, 15 min, 20 min

...

...

...

5.8  Micropipet đa kênh, dung tích từ 5 μl đến 50 μl, từ 50 μl đến 200 μl

5.9  Đĩa lồng, ống nghiệm thủy tỉnh vô trùng

5.10  Đĩa nhựa 96 giếng đáy chữ U

5.11  Bình tam giác 100 ml, 200 ml vô trùng

5.12  Dao, kéo, panh kẹp vô trùng

5.13  Bơm kim tiêm một lần 5 ml, 10 ml

5.14  Cân phân tích có dải đo từ 0 g đến 30 g

5.15  Máy đông khô có nhiệt độ âm sâu tới âm 80 °C

5.16  Ống đông khô giống vô trùng

...

...

...

6.1  Yêu cầu kỹ thuật đối với ống giống

- Lọ kín, không rạn nứt, đảm bảo chân không.

- Hợp chất trong ống giống xốp, màu đồng nhất, độ ẩm dưới 4% và hòa tan hoàn toàn trong nước sinh lý sau 2 min.

6.2  Yêu cầu sinh học của giống

- Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica được nhận dạng bằng phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính hoặc phương pháp ngưng kết trực tiếp trong ống nghiệm (kháng nguyên ngưng kết như hình mạng nhện ở đáy giếng)

- Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica được xác định đặc tính nuôi cấy trên môi trường BHI (4.2.2) có bổ sung 5% huyết thanh ngựa, vi khuẩn sẽ làm cho môi trường nuôi cấy đục vẩn mây, không váng, không cặn.

- Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica được xác định hình thái: Vi khuẩn có dạng trực khuẩn hoặc cầu trực khuẩn nhỏ, gram âm, kích thước 1,0 x 0,3 μm, có khả năng di động.

- Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica được xác định đặc tính sinh hóa: Vi khuẩn không lên men đường, dương tính với các phản ứng Oxidase, Catalase, Urease. Trên môi trường thạch MacConkey có bổ sung 1% đường Glucose, vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc nhỏ, gọn, bóng láng có màu xám xanh. Trên môi trường thạch máu, vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc nhỏ, bóng láng, rìa gọn.

- Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica được kiểm tra tính độc, tính gây miễn dịch trên động vật thí nghiệm, giống đạt yêu cầu khi động vật thí nghiệm được bảo hộ và không có triệu chứng bệnh tích của bệnh viêm teo mũi truyền nhiễm.

...

...

...

7.1  Nhận dạng

Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica (4.1.1) được nhận dạng bằng 1 trong 2 phương pháp sau đây

- Ngưng kết nhanh trên phiến kính (kháng nguyên vi khuẩn sống).

- Ngưng kết chậm trên đĩa 96 giếng (kháng nguyên xử lý axit).

7.1.1  Chuẩn bị giống vi khuẩn

- Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica (4.1.1) đông khô được hoàn nguyên bằng 0,2 ml nước thịt. Ria lên thạch BAB (4.2.2) có bổ sung 5% huyết thanh ngựa, ủ ở tủ ấm (5.1) trong 24 h. Chọn khuẩn lạc cấy vào môi trường BHI (4.2.2) có bổ sung 5% huyết thanh ngựa, ủ ở tủ ấm (5.1) trong 24 h (canh trùng gốc)

- Kháng nguyên, kháng huyết thanh được chuẩn bị như sau:

+ Chuẩn bị kháng huyết thanh: Lấy 0,01 ml canh trùng giống gốc ria trên thạch BAB (4.2.2) có bổ sung 5% máu thỏ, ủ ở tủ ấm (5.1) trong 18 h đến 20 h. Rửa mặt thạch BAB bằng nước sinh lý có 0,3% formalin, thu hoạch huyễn dịch (kháng nguyên chết). Pha loãng huyễn dịch để đạt mật độ vào khoảng 10 x 10⁹ CFU (phương pháp so màu). Tiêm huyễn dịch pha loãng trên theo đường tĩnh mạch cho thỏ (4.1.2) với các liều 0,2 ml, 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml, 2 ml, mỗi liều tiêm cách nhau 3 ngày đến 4 ngày. 1 tuần sau mũi tiêm huyễn dịch pha loãng cuối cùng, tiêm 0,5 ml kháng nguyên sống vào dưới da hoặc bắp thịt cho thỏ. 10 ngày sau khi tiêm kháng nguyên sống, thỏ được lấy máu kiểm tra hiệu giá kháng thể. Kháng huyết thanh được bảo quản ở tủ âm sâu (5.3), một lượng nhỏ có thể bảo quản ở tủ lạnh dương (5.2). Kháng huyết thanh được bổ sung 1/10000 methiolat (4.2.8).

+ Chuẩn bị kháng nguyên: Lấy 0,01 ml canh trùng giống gốc ria trên thạch BAB (4.2.2) có bổ sung 5% máu thỏ, ủ ở tủ ấm (5.1) trong 18 h đến 20 h. Rửa mặt thạch BAB bằng 5 ml nước sinh lý có 0,3% formalin, thu huyễn dịch. Sau đó ly tâm huyễn dịch với gia tốc 12000 rpm trong 20 min ở tủ lạnh (5.2). Bỏ phần nước trong, cặn vi khuẩn được hoàn nguyên bằng 2,5 ml HCI 1N saline (0,85% nước sinh lý trong dung dịch HCI 1N), và ủ qua đêm. Huyễn dịch được ly tâm lần thứ hai, loại bỏ phần nước trong, cặn tế bào được rửa 3 lần bằng PBS (4.2.9). Hoàn nguyên cặn tế bào trong PBS (4.2.9) sao cho cuối cùng huyễn dịch chứa 10¹⁰ CFU/ml.

...

...

...

- Cho 50 μl nước sinh lý vào các giếng như bố trí A1 - D12.

- Tiếp tục cho 50 μl kháng nguyên vào A1, B1 pha loãng theo cơ số 2, 2 dãy C1 - D12 dùng làm đối chứng.

- Ủ ở tủ ấm (5.1) trong 24 h và đọc kết quả:

+ Phản ứng âm tính: Nếu kháng nguyên lắng xuống đáy giếng thành cục tròn, nước ở trên trong.

+ Phản ứng dương tính: Nếu kháng nguyên ngưng kết như hình mạng nhện ở đáy giếng, hiệu giá ngưng kết đọc ở giếng ngưng kết cuối cùng.

7.2  Đặc tính nuôi cấy

- Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica (4.1.1) đông khô được hoàn nguyên bằng 0,2 ml nước thịt.

- Cấy 0,01 ml vi khuẩn đã được hoàn nguyên vào đĩa thạch chocolate bổ sung NAD 5%, ủ ở tủ ấm 37 °C (5.1) trong 24 h, sau đó chọn khuẩn lạc điển hình để cấy vào môi trường nước thịt BHI (4.2.2) có bổ sung 5% huyết thanh ngựa, pH từ 7,2 đến 7,4, yếm khí tùy tiện, ủ ở tủ ấm (5.1) trong 20 h đến 24 h.

- Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica (4.1.1) đạt chỉ tiêu nuôi cấy sẽ làm cho môi trường nuôi cấy đục vẩn mây, không váng, không cặn.

...

...

...

Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica (4.1.1) được hoàn nguyên bằng 0,2 ml nước thịt. Ria 0,01 ml huyễn dịch giống vi khuẩn đã hoàn nguyên lên thạch máu có bổ sung 1% đường Glucose, ủ ở tủ ấm (5.1) trong 24 h. Chọn khuẩn lạc điển hình, cấy vào môi trường BHI có bổ sung 5% huyết thanh ngựa, ủ ở tủ ấm (5.1) trong 24 h.

Ria canh khuẩn lên thạch máu có bổ sung 1% đường Glucose, ủ ở tủ ấm (5.1) trong 24 h. Làm tiêu bản và nhuộm Gram để kiểm tra hình thái.

Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica (4.1.1) đạt chỉ tiêu hình thái sẽ có dạng trực khuẩn hoặc cầu trực khuẩn nhỏ, gram âm, kích thước 1,0 x 0,3 μm, có khả năng di động.

7.4  Đặc tính sinh hóa

Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica (4.1.1) được hoàn nguyên bằng 0,2 ml nước thịt.

Ria 0,01 ml huyễn dịch giống vi khuẩn đã hoàn nguyên lên môi trường thạch MacConkey có bổ sung 1% đường Glucosse, ủ ở tủ ấm (5.1) trong 24 h, vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc nhỏ, gọn, bóng láng có màu xám xanh.

Ria 0,01 ml huyễn dịch giống vi khuẩn đã hoàn nguyên lên môi trường thạch máu, ủ ở tủ ấm (5.1) trong 24 h, vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc nhỏ, bóng láng, rìa gọn.

Vi khuẩn không lên men đường, dương tính với các phản ứng Oxidase, Catalase, Urease.

7.5  Kiểm tra tính độc

...

...

...

- 02 lợn (4.1.3)

- 02 con thỏ (4.1.2)

- 05 chuột nhắt trắng (4.1.4)

7.5.2  Chuẩn bị giống vi khuẩn

Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica (4.1.1) được hoàn nguyên bằng 0,2 ml nước thịt. Ria huyễn dịch giống vi khuẩn đã hoàn nguyên lên thạch máu có bổ sung 1% đường Glucose, ủ ở tủ ấm (5.1) trong 24 h. Chọn khuẩn lạc điển hình, cấy vào môi trường BHI (4.2.2) có bổ sung 5% huyết thanh ngựa, ủ ở tủ ấm (5.1) trong 24 h. Đếm số xác định mật độ vi khuẩn và pha loãng đến các nồng độ cần tiêm.

7.5.3  Cách tiến hành

- Tiêm 1 ml (tương đương với liều 10⁹ CFU/ml) huyễn dịch vi khuẩn đã pha loãng ở (7.5.2) cho lợn theo đường dưới da. Lợn được tiêm huyễn dịch vi khuẩn sẽ chết hoặc có triệu chứng đặc trưng của bệnh viêm teo mũi (thường khịt mũi chảy nước mũi từ dịch màu trong sang màu đục, màu vàng và màu hồng tùy theo từng giai đoạn phát triển bệnh), sống mũi hơi sưng ở hai bên. Nếu lợn bị viêm một bên thì mũi sẽ bị vẹo sang bên bị viêm teo, nếu teo hoàn toàn thì mũi lợn bị ngắn lại và hàm trên ngắn hơn hàm dưới, có trường hợp lợn bị kèm viêm phổi, ho nhiều nhất là khi thời tiết thay đổi, trời rét, lợn ăn thức ăn khô có bụi.

- Tiêm 1 ml (tương đương với liều 10⁹ CFU/ml) huyễn dịch vi khuẩn đã pha loãng ở (7.5.2) cho thỏ theo đường dưới da. Thỏ được tiêm huyễn dịch sẽ chết hoặc có triệu chứng đặc trưng của bệnh viêm teo mũi (chảy nước mũi, hắt hơi, khó thở)

- Tiêm 0,2 ml (tương đương với liều 10⁹ CFU/0,2 ml) huyễn dịch vi khuẩn đã pha loãng ở (7.5.2) cho chuột nhắt trắng theo đường dưới da. Chuột được tiêm huyễn dịch sẽ chết hoặc có triệu chứng đặc trưng của bệnh viêm teo mũi (chảy nước mũi, hắt hơi, khó thở).

...

...

...

7.6.1  Chuẩn bị động vật

Chuẩn bị 6 thỏ (4.1.2)

7.6.2  Chuẩn bị canh khuẩn vô hoạt

Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica (4.1.1) được hoàn nguyên bằng 0,2 ml nước thịt. Ria huyễn dịch giống vi khuẩn đã hoàn nguyên lên thạch máu có bổ sung 1% đường Glucose, ủ ở tủ ấm (5.1) trong 24 h. Chọn khuẩn lạc điển hình, cấy vào môi trường BHI (4.2.2) có bổ sung 5% huyết thanh ngựa, ủ ở tủ ấm (5.1) trong 24 h. Đếm số xác định mật độ vi khuẩn sao cho canh khuẩn đạt khoảng 10¹⁰ CFU/ml.

Tiến hành vô hoạt canh khuẩn bằng formol từ 0,2% đến 0,4%. Để ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày đến 3 ngày.

7.6.3  Cách tiến hành

Tiêm 1ml (tương đương với liều 10⁹ CFU/ml) canh khuẩn vô hoạt ở (7.6.2) cho 3 thỏ (4.1.2) theo đường dưới da. 3 thỏ đổi chứng tiêm PBS (4.2.9) với liều lượng và đường tiêm như tiêm canh khuẩn vô hoạt. Sau 14 ngày thỏ miễn dịch và thỏ đối chứng được tiêm mũi thứ hai với liều lượng và đường tiêm như mũi thứ nhất. 21 ngày sau mũi tiêm thứ hai, thỏ miễn dịch và thỏ đối chứng được thử thách với 2 x 10⁷ CFU vi khuẩn Bordetella bronchiseptica cường độc.

7.6.4  Đọc kết quả

Giống Bordetella bronchiseptica đạt tiêu chuẩn nếu:

...

...

...

7.7  Bồi dưỡng giống vi khuẩn

7.7.1  Chuẩn bị động vật

Chuẩn bị 03 lợn (4.1.3)

7.7.2  Chuẩn bị giống vi khuẩn

Giống vi khuẩn Bordetella bronchiseptica (4.1.1) được hoàn nguyên bằng 0,2 ml nước thịt. Ria huyễn dịch giống vi khuẩn đã hoàn nguyên lên thạch máu có bổ sung 1% đường Glucose, ủ ở tủ ấm (5.1) trong 24 h. Chọn khuẩn lạc điển hình, cấy vào môi trường BHI có bổ sung 5% huyết thanh ngựa, ủ ở tủ ấm (5.1) trong 24 h.

7.7.3  Cách tiến hành

7.7.3.1  Ria 0,01 ml canh khuẩn lên thạch máu có bổ sung 1% đường Glucose, ủ ở tủ ấm (5.1) trong 24 h. Làm tiêu bản và nhuộm Gram để kiểm tra hình thái.

7.7.3.2  Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn và nấm mốc theo TCVN 8684 : 2011.

7.7.3.3  Tiêm cho 2 - 3 lợn (4.1.3), mỗi con 1 ml (tương đương với liều 10¹⁰ CFU/ml) theo đường dưới da.

...

...

...

7.7.3.5  Ria 0,01 ml máu tim lên thạch máu có bổ sung 1% đường Glucose, ủ ở tủ ấm (5.1) trong 18 h đến 24 h. Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào môi trường BHI rồi lặp lại các bước từ 7.7.3.1 đến 7.7.3.5.

7.7.3.6  Cấy máu tim lên thạch thạch máu có bổ sung 1% đường Glucose, ủ ở tủ ấm (5.1) trong 18 h đến 20 h.

7.7.3.7  Chọn khuẩn lạc điển hình cấy lên thạch máu có bổ sung 1% đường Glucose, ủ ở tủ ấm (5.1) trong 24 h.

7.7.3.8  Rửa mặt thạch bằng 5ml huyết thanh ngựa, thu huyễn dịch, chia ra các ống đông khô giống (5.16), mỗi ống 0,2 ml, rồi đông khô.

7.7.3.9  Chạy đông khô theo quy trình của máy đông khô (5.15).

8  Kiểm tra ống giống vi khuẩn sau đông khô

8.1  Kiểm tra đặc tính kỹ thuật của ống giống

- Cảm quan: Quan sát bằng mắt thường, ống giống vi khuẩn được coi là đạt yêu cầu khi lọ kín, không rạn nứt, chế phẩm xốp, màu đồng nhất.

- Chân không: sử dụng máy đo chân không, ống giống vi khuẩn được coi là đạt yêu cầu khi phát huỳnh quang màu ánh tím.

...

...

...

- Độ hòa tan: ống giống vi khuẩn được coi là đạt yêu cầu khi hòa tan hoàn toàn trong nước sinh lý sau 2 min có lắc nhẹ.

8.2  Kiểm tra đặc tính sinh học của giống vi khuẩn

Đạt các chỉ tiêu ở mục 6

9  Bao gói, bảo quản ống giống vi khuẩn sau đông khô

Chọn những ống giống đạt chỉ tiêu ở mục 8 để dán nhãn, bao gói và bảo quản:

9.1  Dán nhãn

- Các ống giống vi khuẩn phải được dán nhãn

- Nhãn phải có các thông tin sau:

+ Nơi sản xuất

...

...

...

+ Số lô...ngày...tháng...năm... sản xuất

+ Người thực hiện

+ Điều kiện bảo quản

9.2  Bao gói và bảo quản

Ống giống được bao gói bằng giấy, để trong túi Polyeste và được giữ ở nhiệt độ 2 °C đến 8 °C trong 2 năm.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] OIE Terrestrial Manual 2012 (Version adopted in May 2012): Chapter 2.8.2. Atrophic rhinitis of swine (Version adopted in May 2012)

[2] ASEAN Standards for Animal Vaccines (Second Edition): Requirements for Bordetella bronchiseptica Bacterin